生長素合成關鍵基因iaaM應用研究進展

廉玉利++李依娜++王煒琪++孟德勇

【摘 要】本文闡述了生長素的種類和生物合成過程，色氨酸單加氧酶是細菌中生長素生物合成過程中的重要限速酶，其編碼基因iaaM已被克隆并在植物基因工程得到廣泛應用。本文重點綜述了轉化iaaM基因可增加植物內源生長素的含量，在改善植物的生長發育狀況，提高作物產量，改良作物品質，誘導單性結實，參與抗逆反應等方面起到了顯著作用，并分析了iaa M基因在植物基因工程中應用研究方向。

【關鍵詞】生長素 色氨酸單加氧酶 植物基因工程

【Abstract】In this paper， the species and biosynthetic process of auxin are elaborated. In bacterium， tryptophan monooxygenase catalyze the rate-limiting step of auxin biosynthesis， and its coding genes have been cloned and used widely in plant genetic engineering .The overview of the iaaM gene transformation can be increased endogenous auxin content which has significant effect in improving growth and development， increasing crop yield and altering crop quality， serving？as？selectionmarker？gene， inducing parthenocarpy， participating in the stress resistance and other aspects.At the last， the paper analyzed the application and research direction of the iaaM gene in plant gene engineering.

【Keywords】auxin； tryptophan monooxygenase gene （iaaM）； plant genetic engineering

生長素是調控植物生長發育最重要的植物激素之一。生長素在調節植物細胞分裂與伸長、向性運動、頂端優勢、細胞衰老、花器官的形成、逆境應答等生長發育都具有十分重要的作用，它對植物的早期發育和形態建成均具有重要意義。色氨酸單加氧酶（IAAM）是細菌中吲哚乙酰胺途徑催化生長素生物合成的關鍵酶，也是最重要的限速酶。本文就生長素的合成、色氨酸單加氧酶基因（簡稱iaaM基因）以及其在植物基因工程上應用進行了綜述，旨在為探索生長素合成機理和生理作用機理及色氨酸單加氧酶基因在植物基因工程上應用奠定理論基礎，同時也為通過基因工程手段調整植物激素水平進行作物遺傳育種展示了廣闊的應用前景。

1 生長素素的生物合成與iaaM基因

研究生長素合成的分子基礎、生化機制以及合成限速酶，對界定生長素在植物發育中的功能、利用基因工程技術調整生長素在植物中的含量以及調節植物生長發育都具有重要作用。

1.1 生長素的生物合成

生長素主要包括3-吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、4-氯吲哚乙酸（4-Cl-IAA）和苯乙酸（PAA）四種類型。IAA是天然植物生長素的主要活性成分，是最早發現的促進植物生長的激素，依據IAA合成過程的中的主要中間產物，把依賴色氨酸的生物合成過程劃分為4個途徑（圖1）：吲哚乙腈途徑、吲哚乙酰胺途徑、吲哚丙酮酸途徑和色胺途徑。其中吲哚乙腈途徑是植物生長素合成過程的次要途徑，在植物的特殊發育階段或特殊環境下啟動，主要存在于十字花科、禾本科、芭蕉科等的一些植物中，最近在葫蘆科、茄科、豆科和薔薇科也發現腈水解酶活性，但在水稻、玉米、煙草中尚未發現該途徑；吲哚乙酰胺途徑僅存在于銅綠色假單胞菌、植物伴生菌和農桿菌等細菌中，能使寄生植物形態發生改變，本途徑在植物中尚未發現。吲哚丙酮酸途徑是高等植物合成IAA的主要途徑，在巴西固氮螺和陰溝腸桿菌等根際固氮菌中也存在該途徑；色胺途徑常與吲哚丙酮酸途徑同時進行，是大麥、 燕麥、煙草、豌豆、擬南芥等植物IAA合成重要途徑[1]。如圖1所示。

1.2 iaaM基因

目前在生化和遺傳上都研究比較透徹的IAA合成途徑是吲哚乙酰胺途徑，該途徑最早發現于假單胞菌，后來在植物伴生菌中得到鑒定。在根癌農桿菌中（圖1），iaaM基因編碼色氨酸單加氧酶，它催化色氨酸轉變為IAM，iaaH基因編碼吲哚乙酰胺水解酶，催化IAM生成IAA的反應，吲哚乙酰胺水解酶是生長素在細菌中生物合成重要限速酶[2]。在擬南芥和煙草中發現的吲哚乙酰胺水解酶與細菌的IAAH催化區域序列同源，都能催化吲哚乙酰胺（IAM）合成IAA，然而，植物尚未發現 iaaM基因和色氨酸單加氧酶，因此植物中存在的該途徑與細菌生物合成IAA過程相似但不相同[1]。

研究微生物中IAA合成途徑的對開展植物體內IAA合成的研究具有重要啟示作用。利用基因工程手段把iaaM基因克隆并轉化到植物中，觀察轉基因植物從分子水平到表型的變化，從而能為研究和調控植物中IAA的表達水平提供強有力的證據支持。

2 iaaM基因的應用

已有研究表明通過轉化iaaM基因可增加植物內源的生長素的含量，具有改善植物的生長發育狀況，提高作物產量，改良作物品質，誘導單性結實，參與抗逆反應等作用。

2.1 對生長發育的影響

生長素對植物形態發育與建成起著重要作用，利用農桿菌來源的iaaM基因的遺傳轉化，有助于研究轉基因植物中生長素水平變化對植物營養器官形態發育的影響。李朝霞[3]研究表明隨著轉iaaM基因植株的IAA水平升高，保衛細胞的長度增加、柵欄組織細胞增大和葉片厚度增加、而氣孔密度減小，葉片長度減少50%，單位面積葉片的細胞數減少，而體積增大，可能是由于過量生長素水平可能減少葉原基分生細胞的分裂次數，但能促進葉細胞生長和分化。荊風雪[4]將來源于棉花纖維細胞高效表達的E6基因啟動子與iaaM構建重組基因轉化黃花蒿，結果表明轉基因植株的腺毛密度與對照組相比提高了約21%，腺毛細胞大小約增加1.16倍。彭彥等[5]將擬南芥韌皮部特異啟動子ASUS1基因啟動子和iaaM融合基因轉入煙草，發現大多轉基因煙草都出現生長異常的生長素過度表型且生長遲緩、葉片卷曲，較野生型煙草植株相比莖的橫切面韌皮部細胞數量顯著增加，排列更加緊密整齊，木質部分化較早，其根部則在韌皮部薄壁細胞處誘生大量根原基，莖段有大量不定根分化，在不定根上有大量側根和根毛的分化。TV Bavrina[6]和VV Alekseeva[7]研究也發現而轉iaaM基因植物中的IAA水平若過量增加，將會引起植株形態不正常，不定根增多，種子不萌發。

2.2 提高作物產量，改良作物品質

生長素具有誘導光合產物向其含量高的部位運輸的能力，是提高灌漿效率的重要調控因子，說明局部生長素合成對作物籽粒灌漿具有重要的生物學功能。在生產實踐中，提高內源或外源生長素水平可有效增加結實率和座果率，增大果實和提高籽粒的重量以提高作物的產量和品質。

Zhang等[8]利用矮牽牛種子表皮特異啟動子FBP7驅動iaaM基因的表達既特異提高了棉花胚珠表皮生長素的含量，且對棉花生長發育和其他農藝性狀也產生影響。實驗結果表明轉FBP7：iaaM基因棉花的種子表皮纖維數量增加且衣分可以達到48%以上，提高了近15%，纖維細度也有明顯改善，實現產品和品質性狀同步提高。Mezzetti B等[9]等將驅動胚珠及子房基因的特異表達的啟動子DefH9與iaaM融合基因導入薔薇科的草莓和覆盆子，研究結果表明轉基因植株花序的數量和每個花序的座果數量均增加，單個果實的重量和尺寸也增加，最終使轉基因草莓和覆盆子的產量分別增加180%和100%，同時能使去雄的轉基因草莓和覆盆子單性結實。文秀紅[10]將種子特異啟動子SSP與iaaM融合基因轉入油菜，轉基因植株在形態上未表現出生長素含量過高的表現，植株的種子增大增多，增產達15.2%。研究者們利用IAA可使植物的莖伸長、木質化加劇的特點，發現轉iaaM基因的楊樹或其他木材植物，節間伸長，葉面積增大，有強的頂端優勢，高度和莖的直徑均增加，增加了其作為木材的優良品質[11，12]。對轉基因番茄、葡萄、草莓等果蔬的成分分析表明，果實顏色、可溶性固體、干物質總量、有機酸、總多酚等果實質量相關重要參數無明顯差異。

2.3 作為選擇標記基因

iaaM基因作為一個選擇標記基因，其表達有利于促進不定芽的分化并導致轉基因植株表型發生反常變化。因此，iaaM基因可作為簡單的表型標記篩選轉化子，直觀的指示轉化是否成功。劉春明等將iaaM和iaaH基因導入煙草細胞后，可以在沒有2， 4-D的情況下誘導體細胞胚的形成[13]。Zheng X[14]等將p35S（CaMV35S啟動子）-pAGL5（胚珠特異啟動子）-iaaM、p35S-iaaM、pAGL5-iaaM、pNOS（農桿菌胭脂堿合成酶基因啟動子）-pAGL5-iaaM 4個表達載體轉化煙草，結合植株的表型變化和RT-PCR檢測iaaM基因在根、莖、葉、花、果實中的表達水平，證明了CaMV35S啟動子具有將毗鄰的組織或器官特異啟動子覆蓋的能力。Alida Ballester[15]利用ipt（異戊烯基轉移酶基因）聯合iaaM/H作為選擇標記基因遺傳轉化柑橘和甜橙時，轉化率分別達7.2%和6.7%。

2.4 誘導單性結實

單性結實是人們獲得無籽果實的有效途徑之一，iaaM基因的胚珠特異性表達提高果實中生長素濃度，刺激子房發育成果實，可創造遺傳穩定的單性結實品種，為植物單性結實育種提供了新的基因和思路。Rotino等把DefH9與iaaM融合基因導入茄子，提高IAA在胚珠、子房等組織的合成水平，獲得100%的單性結實座果率，產品質量也得到了提高。Pandolfini等將改良融合基因DefH9-RI-iaaM導入番茄，所結單性番茄果實無畸形果且品質較高。目前，iaaM基因已被應用用于煙草、覆盆子、黃瓜、草莓等植物單性結實。

2.5 抗逆作用

生長素在植物生根中起中心作用，很多誘發生根因子都是通過生長素起作用的。體外施加生長素可促進不定根和側根的生長發育，且內源生長素含量升高的轉基因或突變植株均表現出側根增加，抗旱能力增強。轉iaaM基因的轉基因煙草根系發達、含水量高、保水能力強、耐熱性和抗旱性強。吳忠義研究表明外源IAAM/AtCKX3基因在玉米的根中特異性表達，促進了根系的生長發育，從而提高了玉米的抗旱性，且轉基因株系在正常澆水條件下的生長發育沒有受到抑制。該研宄說明促進根系的生長發育才是提高植物抗旱性的關鍵有效途徑，為抗旱新種質材料創制提供了一個新的思路。

特定啟動子調控下的iaaM基因表達引起的單性結實，在不利于授粉的條件下也能保持產量的穩定，因而轉iaaM基因的單性結實作物本身就具有一定的抗逆能力。Rotino GL等實驗結果表明轉iaaM基因的番茄在花期、座果期出現顯著高溫， 仍然保持了相當高的產量，單果數增加。Rotino GL等獲得的轉基因茄子在寒冷的冬季也能正常坐果。

除此之外，趙麗紅研究發現iaaM和ACC脫氨基酶基因的協同表達可提高植物對重金屬的吸收和組織中中金屬的含量，還有研究發現把iaaM基因轉化根際微生物，iaaM基因表達的產物能促進其寄生植物的抗旱性和抗病原菌能力。

3 展望

近年來，隨著分子生物學的迅猛發展，基因工程技術廣泛地應用于植物的遺傳與改良，大力推動了生長素和iaaM基因在植物基因工程的研究與應用，但解析植物中生長素的合成代謝與器官發生發育過程的關系還需進一步探討，對于轉iaaM基因的植株中生長素與其它激素相互作用機制以及激素對植物生長發育的作用還需進一步探究，大部分轉iaaM基因的研究還處于轉化階段，對轉基因植物的生理方面還有待在細胞水平和分子水平進行深入研究。隨著更多優良特異啟動子的發現，利用iaaM基因將培育出更多產量高和品質優的作物新品種。

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