高效液相色譜法測定老蔻丸中大黃酚含量

苑思坤，王庚南，崔明旭

（1．河北省保定市食品藥品檢驗所，河北 保定 071000； 2．河北農(nóng)業(yè)大學，河北 保定 071000； 3．沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110000）

高效液相色譜法測定老蔻丸中大黃酚含量

苑思坤1，王庚南2，崔明旭3

（1．河北省保定市食品藥品檢驗所，河北 保定 071000； 2．河北農(nóng)業(yè)大學，河北 保定 071000； 3．沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110000）

目的 建立測定老蔻丸中大黃酚含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱為 Waters Sunfire C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），流動相為甲醇－0．1%磷酸（80∶20），流速為 1．0 mL／min，檢測波長為 254 nm，柱溫為25℃。結果 該方法專屬性強，大黃酚進樣量在0．015 70～0．784 85 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，平均加樣回收率為99．54%，RSD＝1．48（n＝6）。結論 該方法操作簡便，結果準確，重復性良好，可用于老蔻丸的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；老蔻丸；大黃酚

中成藥老蔻丸由大黃、當歸、豆蔻、砂仁、肉桂、丁香、山楂、六神曲等24種中藥材組方，具有開郁舒氣、溫胃消食的功效，臨床主要用于肝郁氣滯、飲食不消、膨悶脹飽、胃脘疼痛等病癥[1]。方中大黃具有健胃[2－3]、增進食欲、促進消化的功效，對慢性胃炎有較好的療效[4]。祝金泉等[5]在關于大黃對胃黏膜細胞功能影響的研究中發(fā)現(xiàn)，大黃可促進胃黏膜主細胞分泌胃蛋白酶，并可輕度增加胃黏膜細胞的增殖作用。文獻[6－11]報道，大黃對于老年胃潰瘍、應激性胃潰瘍及胃潰瘍出血有良好的療效。大黃酚是大黃的主要成分之一，老蔻丸現(xiàn)行質(zhì)量標準[1]中無含量測定項。為加強對該藥品的質(zhì)量控制，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法，對制劑所含有效活性成分大黃酚進行含量測定。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，2998型DAD檢測器，Waters Sunfire C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），均由美國Waters公司生產(chǎn)；BT125D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1．2 試藥

大黃酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110796－201118，含量為99．5%，供含量測定用）；老蔻丸（藥都制藥集團股份有限公司，批號分別為140601，141101，150401）；甲醇為色譜純（美國Fisher公司）。

2 方法與結果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Waters Sunfire C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－0．1%磷酸（80∶20）；流速：1．0 mL／min；柱溫：25℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按大黃酚峰計算應不低于3 000。

2．2 溶液制備

對照品溶液：稱取大黃酚對照品0．015 76 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含大黃酚15．70 μg的對照品溶液。

供試品溶液：取供試品，剪碎，精密稱取5 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇10 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：取除大黃的其余藥材，按制備工藝和處方比例制備陰性制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2．3 方法學考察

專屬性試驗：取處方中除大黃以外的23味中藥材，按處方劑量及工藝要求制備缺大黃的陰性對照品，按2．2項下方法制成陰性對照品溶液。分別取供試品溶液、陰性對照品溶液和對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果，陰性對照品溶液色譜中，在與大黃酚峰相同保留時間處，無相同色譜峰出現(xiàn)，表明除大黃外的其他原輔料對大黃酚峰均無干擾，見圖1。

線性關系考察：分別精密吸取2．2項下制備的對照品溶液 1，2，5，10，20，50 μL注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝5 503．5 X－57 875，r＝0．999 9（n＝6）。結果表明，大黃酚進樣量在0．015 70～0．784 85 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取2．2項下制備的對照品溶液，按擬訂色譜條件重復進樣6次，測定大黃酚峰面積積分值。結果的 RSD＝0．46%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，在擬訂色譜條件下分別于2，4，6，8，10，12 h時進樣測定大黃酚峰的面積。結果的 RSD＝1．03%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批供試品（批號為140601）6份，按2．2項下方法制備供試品溶液，依法進樣測定，以外標法計算峰面積。結果大黃酚的平均含量為0．097 12 mg／g，RSD＝1．26%（n＝6），表明該方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取6份已知含量的供試品（批號為140601，大黃酚含量為為0．096 82 mg／g）各5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，分別精密量取貯備液0．5，1．0，2．0 mL各3份，加入6份樣品中，按2．2項下方法制備供試品溶液，各進樣10 μL，測定并計算回收率。結果見表1。

2．4 樣品含量測定

按擬訂方法制備3批（批號分別為140601，141101，150401）樣品的供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標法計算樣品含量。結果3批樣品中大黃酚的含量分別為0．096 82，0．106 44，0．113 80 mg／g。

表1 大黃酚加樣回收試驗結果（n＝6）

3 討論

老蔻丸屬中藥復方制劑，具有健胃消食、開郁舒氣、溫胃養(yǎng)胃的作用，方中大黃為寥科植物掌葉大黃Rheum palmatum L．、唐古特大黃 Rheum tanguticum Maxim．ex Balf．或藥用大黃 Rheum officinale Baill．的干燥根和根莖[12]，有瀉熱通暢、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、攻積導滯、利膽退黃之功效[13]，《神農(nóng)本草經(jīng)》稱大黃“主下瘀血、血閉、寒熱、破 瘕積聚、留飲、宿食、蕩滌腸胃、通利水谷、調(diào)中化食、安和五藏”。而大黃酚為大黃中主要活性成分，故本試驗中以大黃酚為指標，采用高效、便捷、準確的HPLC法測定其含量。

檢測波長選擇：本試驗中采用二極管陣列檢測器，于200～400 nm波長范圍進行紫外光譜掃描，結果顯示大黃酚在254 nm波長處有最大吸收，故選擇254 nm作為檢測波長。

流動相選擇：參考文獻[14－17]，經(jīng)反復試驗與篩選，本試驗中最終采用了甲醇－0．1%磷酸（80∶20）作為流動相。結果大黃酚峰形良好，塔板數(shù)高，與周圍雜質(zhì)分離較完全，且方法的專屬性、精密度、重復性與穩(wěn)定性均較好。

提取方式選擇：參考文獻[16－17]，制劑中大黃酚的提取可采用甲醇、鹽酸2次回流，再用三氯甲烷多次振搖提取的方法。經(jīng)試驗，的確可去除大量雜質(zhì)，但操作過于煩瑣，步驟過多，在操作過程中易產(chǎn)生誤差。本研究中供試品溶液的制備采用了超聲處理的方法，分別超聲10，20，30，40 min，測得大黃酚的含量最高為超聲30 min和40 min，認為大黃酚在超聲30 min基本提取完全，故選用甲醇超聲處理30 min為宜。由試驗結果可見，超聲提取的方法能確保大黃酚測定方法的良好專屬性及回收率，且操作簡便，提高了試驗效率及試驗的準確性。

耐用性考察：選取了3種不同品牌的色譜柱，即Waters Sunfire C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），資生堂Capcell Pak C18柱（200 mm×4．6 mm，5 μm），Phenomenex ODS3 C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），測定同一批樣品，結果3種色譜柱測定結果重復性均較好。

柱溫試驗：分別選擇柱溫為25℃和40℃時進樣測定大黃酚的含量，結果兩者基本無差異，說明在不同柱溫測定的結果重復性較好。最終選擇接近室溫的25℃為柱溫箱設定溫度。

綜上所述，本試驗中建立的HPLC法操作簡便，專屬性強，線性方程、精密度、重復性、回收率均滿足要求，可作為中藥老蔻丸的質(zhì)量控制方法。

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Content Determination of Chrysophanol in Laokou Pills by HPLC

Yuan Sikun1，Wang Gengnan2，Cui Mingxu3
（1．Baoding Institute for Food and Drug Control，Baoding，Hebei，China 071000； 2．Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei，China 071000；3．ShenyangPharmaceutical University，Shenyang，Liaoning，China 110000）

Objective To establish an HPLC method for determination of the content of chrysophanol in Laokou Pills．M ethods Waters Sunfire C18column（250 mm×4．6 mm，5 μm）was used，the mobile phase was Methanol－0．1% phosphoric solution（80∶20），the flow rate was 1．0 mL／min，the detection wavelength was 254 nm，the column temperature was 25℃．Results This method had good specificity．The good linear relationship was found in the range of 0．015 70－0．784 85 μg，and the average recovery rate was 99．54%，RSD＝1．48(n＝6)．Conclusion This method has the advantages of simple operation，accurate results，and good reproducibility，can be used for the quality control of Laokou Pills．

HPLC；Laokou Pills；chrysophanol

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)10－0063－03

苑思坤（1983－），男，碩士研究生，主管藥師，研究方向為藥品檢驗、藥物質(zhì)量評價及分析，（電話）0312－5906326（電子信箱）yuansikun＠sina．com；王庚南（1984－），女，講師，研究方向為藥物分析、藥物代謝動力學，本文通訊作者，（電話）0312－2020700（電子信箱）yiyuone＠sina．com。

2015－08－13；

2015－12－06)