托吡卡胺滴眼液的抑菌效力測定

周劍

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121）

托吡卡胺滴眼液的抑菌效力測定

周劍

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121）

目的 測定托吡卡胺滴眼液中抑菌劑的抑菌效力。方法 以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、黑曲霉和白色念珠菌為試驗菌株，進行菌落計數方法學驗證和微生物挑戰試驗，根據各間隔時間的菌數lg值相對于初始值減少程度評價托吡卡胺滴眼液對細菌、真菌的抑菌效力。結果 部分托吡卡胺滴眼液中抑菌劑的抑菌效力符合2010年版《中國藥典》的規定，但不符合2015年版《中國藥典》通則1121抑菌效力檢查法的規定。結論 2010年版《中國藥典》和2015年版《中國藥典》通則1121抑菌效力的判斷標準差異較大，部分已上市品種的抑菌劑效力達不到2015年版《中國藥典》的要求。

托吡卡胺滴眼液；抑菌效力；評價

眼用制劑為多劑量包裝制劑，易在貯藏和使用過程中發生微生物污染和繁殖，對藥物的質量及療效產生影響[1]，需加入抑菌劑，避免微生物生長與繁殖[2]。若無合理的防腐體系，環境中的微生物一旦大量侵入，則有可能破壞產品的品質或損害患者健康。建立良好的防腐體系，對于滴眼液的品質十分重要[3]。托吡卡胺滴眼劑，適應證為滴眼散瞳和調節麻痹，在使用中需反復打開，易被淚液及空氣中的微生物污染，從而產生安全隱患[4－5]。對其抑菌劑的抑菌效力進行測定，可有效保障產品質量，而目前尚未見托吡卡胺滴眼液抑菌效力研究的報道，實際檢測結果與2010年版《中國藥典》[6]、2015年版《中國藥典》[7]抑菌效力差異較大，故按照2個版本的《中國藥典》中的抑菌效力檢查法對托吡卡胺滴眼液的抑菌效力進行了考察，現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1．1 儀器

1．2 試藥

托吡卡胺滴眼液（山東博士倫福瑞達制藥有限公司＜簡稱山東博士倫＞，批號為140809；安徽雙科藥業有限公司 ＜簡稱安徽雙科 ＞，批號為140703，規格均為6 mL∶15 mg）；營養肉湯培養基（批號為130520）、胰酪胨大豆瓊脂培養基（批號為141112）、改良馬丁培養基（批號為 1402032）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為20130710）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1．3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、銅綠假單胞菌[CMCC（F）98003]均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2．1 菌種及菌液制備

菌種：枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]。

菌液制備：取經35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌肉湯培養物，分別用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 mL含菌約108cfu的菌懸液，備用。取經25℃培養18～24 h的白色念珠菌液體培養物，用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 mL含菌約108cfu的菌懸液，備用。取經25℃培養6 d的黑曲霉菌斜面培養物，加入含0．05%（mL／mL）聚山梨酯80的0．9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）置無菌試管內，用0．9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子108cfu的孢子懸液。

2．2 試驗方法

大豆卵磷脂稀釋液是近年稀釋液研究的熱點，Forouzanfar等[8]在冷凍保存綿羊精液試驗中，發現用1%大豆卵磷脂效果高于15%卵黃，證明大豆卵磷脂可以替代卵黃。Depaz等[9]用大豆卵磷脂在低溫與常溫下保存綿羊精液，結果表明精子在卵黃中的運動性較差。本試驗在0 ℃冰水混合物中保存綿羊精液，發現使用1. 25%大豆卵磷脂替代卵黃保存精子效果顯著高于其他濃度(P<0. 05)，與蔡虹[10]等3%的添加量，孟娜娜[11]等0. 375%最優添加量有一定偏差。所以證明為了確保精子的運動處于最好的狀態，大豆卵磷的添加劑量必須有一定的限度。

受試品溶液制備：直接取樣品作為受試品溶液。

供試品接種：取受試品溶液5份，轉移至5個適宜的無菌容器中，每個容器接種1種試驗菌，供試品中接種菌量為105～106cfu，充分混勻，使供試品中的試驗菌均勻分布。然后將接種的供試品在試驗期間置22℃避光保存。

存活菌測定：在供試品接種0 h，6 h，1 d，7 d，14 d，28 d時，分別從上述每個容器中取供試液 1 mL，用pH＝7．0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液稀釋，采用平皿法進行存活菌數測定，細菌測定用胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養基，真菌測定用沙氏葡萄糖瓊脂培養基。根據菌數測定結果計算1 mL供試品各試驗菌所加菌數及各間隔時間的菌數，并換算成lg值。

2．3 試驗結果

2．3．1 微生物挑戰性試驗

結果見表1。

表1 微生物挑戰性試驗結果

2．3．2 存活菌測定結果

與初始值比較，7 d后存活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌菌數的lg值下降均大于1．0，符合2010年版《中國藥典》規定；與初始值比，14 d后存活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌菌數的lg值下降均大于3．0，符合2010年版《中國藥典》規定；與14 d的菌數相比，28 d后存活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌菌數均未增加，符合2010年版《中國藥典》規定；樣品的真菌數與初始值比，7，14，28 d的黑曲霉和白色念珠菌菌數均未增加，符合2010年版《中國藥典》要求。可見，2個廠家生產的托吡卡胺滴眼液中抑菌劑的抑菌效力均符合2010年版《中國藥典》中抑菌效力檢查法的判斷標準。詳見表2。

2．3．3 抑菌效力檢查結果

與接種的細菌菌數lg值相比，6 h存活的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌數lg值下降，山東博士倫6 h存活的銅綠假單胞菌下降值為2．4，滿足2015年版《中國藥典》規定應達到的抑菌效力“A”標準，其余下降值均小于2．0，不能滿足上述標準；1 d存活的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌數lg值下降，山東博士倫下降值均大于3．0，滿足公示稿中要求的應達到的抑菌效力“A”標準，而安徽雙科均小于3．0，不能滿足公示稿中的同一標準；7 d存活的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的lg值2個廠家下降均大于3．0；14 d和28 d，2個廠家的滴眼液均未檢出試驗菌。可見，托吡卡胺滴眼液中抑菌劑的抑菌效力存在不符合2015年版《中國藥典》中的抑菌效力判斷“A”標準的情況。詳見表3。

表2 7，14，28 d后與初始值相比lg值下降值

與接種的真菌菌數lg值相比，2個廠家7 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的 lg值下降值均大于 2，滿足2015年版《中國藥典》中規定應達到的抑菌效力“A”標準；2個廠家14 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的lg值下降值均大于1，滿足2015年版《中國藥典》中規定應達到的抑菌效力“B”標準（14 d lg值下降值判定，2015年版《中國藥典》“A”標準無相關規定）；與14 d的真菌菌數相比，2個廠家28 d存活的黑曲霉和白色念珠菌的菌數未增加，滿足2015年版《中國藥典》中規定應達到的抑菌效力“A”標準。詳見表4。

表3 與接種細菌菌數lg值相比不同時間點下降值

表4 與接種真菌菌數lg值相比不同時間點下降值

3 討論

抑菌效力檢查無論是對消費者還是生產企業都至關重要，防腐劑添加過少，會使微生物繁殖而引起污染，防腐劑添加過多，會引起不適或過敏等不良反應，故適量添加防腐劑尤為重要[8]。2015年版《中國藥典》更新了抑菌效力檢查法，并根據歐美藥典的最新要求提高了抑菌效力的判斷標準[9]。多劑量包裝的滴眼液需在處方中適當添加適宜的抑菌劑來保持產品在貯存和使用過程中具有一定的抑菌能力[10]。同時，添加的抑菌劑多少都會具有一定毒性，故必須進行充分的試驗研究，嚴格控制抑菌劑的種類和用量，保證用藥安全[11]。

不同廠家生產的滴眼液的抑菌效力存在較大差異，如何選擇抑菌劑，以及如何實現藥物中所含抑菌劑的量為最低有效劑量，仍為抑菌效力檢查試驗的難點[12－13]。抑菌劑使用量的界限一直都很模糊，過量易導致人體受損，不足則增加微生物污染的可能性[1]。目前，國內市場上的滴眼液可能存在防腐劑遠超抑菌效力要求的情況。如張世磊等[2]在萘敏維滴眼液抑菌效力試驗中發現，7 d所有試驗菌株的菌落數均下降為0；肖璜等[5]研究發現，現行產品氯霉素滴眼液中的尼泊金乙酯處方濃度偏高。安彥[14]的研究結果顯示，抑菌劑的效力不僅與所使用的抑菌劑種類及含量相關，同時也與其他成分及制劑工藝有關，特別應關注pH、等電點、表面活性劑、生物制劑的蛋白含量等因素，其協同效應值得進一步研究，也提示對添加抑菌劑的制劑進行抑菌劑效力評價的必要性[15]。

四國藥典[《美國藥典》（USP)，《歐洲藥典》(EP)，《日本藥典》(JP)，《中國藥典》(ChP)]均收載有抑菌劑效力檢查法，但測定方法和標準并不統一，EP要求考察6，24 h和7，14，28 d共5個時間點，USP和ChP要求考察7，14，28 d 3個時間點，而JP僅考察14，28 d 2個時間點[16]。本研究中結合ChP和EP的相關要求，在6 h，24 h，7 d，14 d，28 d共5個時間點進行考察，更能比較出不同產品抑菌劑效力之間的差異，也更符合滴眼液實際用藥的需要。

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Bacteriostatic Effect Assay of Tropicamide Eye Drops

Zhou Jian
（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing，China 401121）

Objective To detect the bacteriostatic effect of Tropicamide Eye Drops．M ethods Staphylococcus aureus，Pseudomonas aeruginosa，Escherichia coli，Aspergillus and Candida albicans were used as test strains，the colony－count method validation was studied．According to the verified method，the microbiological method and various time－gap colony counting lg，compared with original value，were applied to evaluate bacteriostatic effects of Tropicamide Eye Drops for bacteria and fungus．Results The effect of bacteriostatic agent of pirenoxine ophthalmic solution was confoumable to the standard of Ch．P（2010），but was not confoumable to the standard of the general public draft 1121 of Ch．P（2015）．Conclusion There are great differences for the estimate standard of preservatives－effectiveness between the Ch．P（2010）and the general public 1121 of Ch．P（2015），and the preservatives－effectiveness in part of the listed varieties do not meet the requirement of the latter．

Tropicamide Eye Drops；bacteriostatic effect；evaluation

R927．11；R988．1

A

1006－4931(2016)10－0069－03

周劍（1980－），男，大學本科，工程師，研究方向為藥物分析微生物，（電子信箱）40257199＠qq．com。

2016－01－10；

2016－02－09)