超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)不同品種龜甲制龜甲膠的牛皮源成分

彭婷婷，江 勛

（湖南省衡陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽 421001）

超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)不同品種龜甲制龜甲膠的牛皮源成分

彭婷婷，江 勛

（湖南省衡陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽 421001）

目的 考察不同品種的龜甲原料對(duì)龜甲膠中牛皮源成分含量的影響。方法 采用超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC－MS），色譜柱為Zorbax C18柱（50 mm×2．1 mm，1．8 μm），以0．1%甲酸水－0．1%甲酸乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為0．3 mL／min，柱溫為40℃。分別以不同品種龜甲為原料熬制龜甲膠，并對(duì)其牛皮源的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果 純草龜龜甲熬制的龜甲膠檢測(cè)結(jié)果為牛皮源陰性，摻雜巴西龜龜甲的龜甲膠檢測(cè)結(jié)果為牛皮源陽性。結(jié)論 該方法簡便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可有效控制龜甲膠質(zhì)量。

超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法；龜甲；龜甲膠；牛皮源成分

膠類藥材是指由動(dòng)物的皮、骨骼等加工而成的膠原蛋白，是我國特有的一類中藥[1]，包括阿膠、龜甲膠、鹿角膠、黃明膠等品種。龜甲膠最早見于《本草崇源》一書，為龜甲經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠[2－3]，具有滋陰、養(yǎng)血、止血等功效。近年來，由于生產(chǎn)原料來源有限，價(jià)格高昂，且現(xiàn)行《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)并不能檢測(cè)出龜甲膠中是否添加其他膠類成分，部分生產(chǎn)企業(yè)為降低成本，在龜甲膠熬制過程中摻雜價(jià)廉易得的牛皮，甚至廢舊皮革以謀利，使得市面上龜甲膠質(zhì)量參差不齊[4]。國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）已出臺(tái)了補(bǔ)充檢驗(yàn)方法批準(zhǔn)件（批件號(hào)為2014013），采用高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)膠類藥材酶解產(chǎn)物中的特征性多肽進(jìn)行檢測(cè)[5－6]，可對(duì)龜甲膠中牛皮源成分進(jìn)行定性檢測(cè)。但日常檢測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)，一些采用不同品種龜甲熬制的樣品用該方法檢測(cè)也呈牛皮源陽性。由于《中國藥典》并未對(duì)原料中的龜甲品種有要求，為此，本研究中采用了超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC－MS）法對(duì)以巴西龜和中華草龜?shù)凝敿诪樵习局频凝敿啄z中牛皮源成分進(jìn)行了定性檢測(cè)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1290－6460A型超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀；Mettler AE240型電子分析天平；SCQ50型超聲清洗機(jī)（上海申波超聲公司）；XW－80A型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1．2 試藥

龜甲膠對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為121693－201301）；黃明膠對(duì)照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為121695－201301）；序列分析級(jí)胰蛋白酶（Promega公司）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純；試驗(yàn)用龜甲膠樣品均為實(shí)驗(yàn)室制得。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與質(zhì)譜條件

2．1．1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18柱（50 mm×2．1 mm，1．8 μm）；流動(dòng)相：A為0．1%甲酸水溶液，B為0．1%甲酸－乙腈，梯度洗脫（0～7 min，5%B→20%B；7～10 min，20%B→50%B；10～10．1min，50%B→5%B；10．1～13 min，5%B）；流速：0．3 mL／min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2．1．2 質(zhì)譜條件

Agilent 6460A QQQ質(zhì)譜系統(tǒng)。離子化模式為ESI＋；霧化器壓力為20 Psi；毛細(xì)管電壓為3 kV；干燥氣溫度為300℃；干燥氣流速為6 L／min。采用MRM采集模式：以 m／z 641．3（雙電荷）→726．2（定量離子對(duì)）和m／z 641．3（雙電荷）→783．3為檢測(cè)離子對(duì)。

2．2 溶液制備

牛皮源成分參比溶液：取黃明膠對(duì)照藥材0．1 g，置50 mL容量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至刻度，取溶液5 mL，置100 mL容量瓶中，加龜甲膠基質(zhì)溶液（取龜甲膠對(duì)照藥材粉末0．1 g，置50 mL容量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至刻度，即得）稀釋至刻度，過0．22 μm濾膜，取續(xù)濾液50 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析級(jí)胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成1 g／L的溶液，臨用前新配）8 μL，37℃恒溫酶解12 h，即得。進(jìn)樣測(cè)定，其色譜－質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 超高效液相色譜－質(zhì)譜圖

供試品溶液：取龜甲膠樣品0．1 g，置50 mL容量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液溶解并稀釋至刻度，過0．22 μm濾膜，取續(xù)濾液50 μL，加胰蛋白酶溶液8 μL，37℃恒溫酶解12 h，即得。

2．3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取牛皮源成分參比溶液和5號(hào)供試品溶液，進(jìn)樣5 μL，連續(xù)測(cè)定 6次。結(jié)果的 RSD分別為0．97%和1．01%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取5號(hào)供試品溶液，于0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣5 μL。結(jié)果的 RSD為0．84%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取5號(hào)供試品6份，按樣品測(cè)定方法試驗(yàn)，分別制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果的 RSD為0．96%(n＝6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2．4 樣品含量測(cè)定

取5批不同原料制備的龜甲膠，依法制備供試品溶液，按擬訂方法測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 不同原料龜甲膠樣品牛皮源成分檢測(cè)結(jié)果

3 討論

中華草龜是我國的原生物種，其龜甲入藥已有幾千年的歷史，近年來受到過度捕獵的威脅，草龜已被世界自然保護(hù)聯(lián)盟列為瀕危物種。巴西龜原產(chǎn)于美洲，屬外來物種，其適應(yīng)性強(qiáng)、食性廣且生長繁殖極其迅速，目前已因其大量掠奪同類的生存資源而被列為世界最危險(xiǎn)入侵物種之一。由于市面上草龜龜甲的售價(jià)大大超過巴西龜龜甲，且《中國藥典》對(duì)熬制龜甲膠所用的龜甲原料無明確要求，一些不良廠家為了節(jié)約生產(chǎn)成本而大量采用價(jià)廉易得的巴西龜龜甲入藥。

本試驗(yàn)中曾試用0．1%甲酸水溶液－乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該流動(dòng)相下對(duì)牛皮源成分的響應(yīng)較低，因此改用0．1%甲酸水溶液－0．1%甲酸乙腈為流動(dòng)相，以增強(qiáng)其響應(yīng)。另考慮到不同批次的胰蛋白酶活性不一，為增強(qiáng)酶解效率，提高儀器響應(yīng)，樣品酶解量改為50 μL樣品加8 μL酶溶液。

本試驗(yàn)中分別以草龜龜甲和巴西龜龜甲為原料，通過調(diào)整不同的龜甲比例對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制的5種龜甲膠樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)純草龜龜甲熬制的膠中牛皮源成分測(cè)定結(jié)果為陰性，而巴西龜龜甲膠中牛皮源成分陽性，且該方法對(duì)巴西龜龜甲檢測(cè)靈敏度極高，檢出限為1 g／kg。因此，該方法不僅可以對(duì)廠家違法添加牛皮的行為進(jìn)行監(jiān)督，同時(shí)也杜絕了廠家大量使用巴西龜龜甲代替草龜龜甲的可能，為有效控制龜甲膠質(zhì)量提供了一定的參考依據(jù)。

[1]程顯隆，李文杰，魏 鋒，等．動(dòng)物膠類藥材的鑒別方法研究進(jìn)展[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7（3）：167－168．

[2]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：169．

[3]王海波，申二永，宋漢敏，等．微波消解－電感耦合等離子體光譜法測(cè)定龜甲膠中鉻的含量[J]．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（4）：378－379．

[4]程顯隆，李文杰，張小龍，等．UPLC－QTOF－MS結(jié)合主成分分析法用于龜甲膠、鹿角膠中添加牛皮源成分的檢測(cè)研究[J]．藥物分析雜志，2012，32（6）：931－935．

[5]張貴鋒，劉 濤，王 前，等．高效液相色譜／質(zhì)譜法識(shí)別不同明膠酶解產(chǎn)物中特征多肽[J]．分析化學(xué)研究報(bào)告，2008，36（11）：1 499－1 504．

[6]王 前，張貴鋒，劉 濤，等．高效液相色譜質(zhì)譜鑒別龜甲膠與鹿角膠[J]．光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（10）：519－520．

Identification of Bovine－Hide Gelatin from Glue of Tortoise Shell M ade by Different Kinds of Tortoise Shell by UPLC－MS

Peng Tingting，Jiang Xun
（Hengyang Center of Food and Drug Control，Hengyang，Hunan，China 421001）

Objective To investigate the influence of using different kinds of tortoise shell on the content of bovine－h(huán)ide gelatin from glue of tortoise shell．M ethods The UPLC－MS method was performed on the Zorbax C18column（50 mm×2．1 mm，1．8 μm），by a gradient elution using 0．1% formic acid aqueous solution－0．1% formic acid in acetonitrile as the mobile phase at a flow rate of 0．3 mL／min and at 40℃．Glue of tortoise shell were detected which were made from different kinds of tortoise shell．Results It was founded that the test results were positive which contained Trachemys scripta eleganns shell，while negative results were detected which were made by pure Chinemys reevesiis shell．Conclusion The method is simple，accucate，specific and high sensitivity which provided a basis for quality′s effective control of glue of tortoise shell．

UPLC－MS；tortoise shell；glue of tortoise shell；bovine－h(huán)ide gelatin

R286．0；R282．74

A

1006－4931(2016)10－0072－02

彭婷婷（1986－），女，湖南衡陽人，碩士研究生，主要從事食品藥品檢驗(yàn)工作，（電話）0734－8800112；江勛（1981－），男，湖南衡陽人，大學(xué)本科，主管藥師，主要從事食品藥品檢驗(yàn)工作，本文通訊作者，（電話）0734－8800112。

2016－01－14；

2016－02－05)