納米免疫傳感器法快速測定糧油食品中的黃曲霉毒素B1

王瑞鑫 李書國

納米免疫傳感器法快速測定糧油食品中的黃曲霉毒素B1

王瑞鑫 李書國

（河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊 050018）

以改性殼聚糖為固定化材料，包埋固定納米金膠微粒及黃曲霉毒素B1抗體制備信號放大型納米免疫傳感器，建立了免疫傳感器測定黃曲霉毒素B1的方法；優化了納米免疫傳感器的制備條件及檢測參數；基于AFB1抗體與抗原之間的特異性免疫反應，以K3［Fe（CN）6］為探針，利用循環伏安法和差分脈沖伏安法研究了其免疫反應對傳感器響應電流的影響，結果表明免疫響應電流與底液中AFB1的濃度在0.1～1.1 ng／g范圍內成線性關系，其校正曲線方程為IP＝ -4.927 4x+15.108（R2＝0.991 2），其最低檢測限為0.05 ng／g（S／N ＝3）；該免疫傳感器的穩定性和重現性較好。利用該法對花生油、玉米油等實際樣品中的AFB1進行了檢測，其回收率為在87.8～98.2%，檢測精確度優于ELISA試劑盒法，用于糧油食品中黃曲霉毒素的快速檢測是可行的。

黃曲霉毒素B1免疫傳感器 納米金 快速檢測 食品安全

黃曲霉毒素是一種具有強烈生物毒性和強致癌性的化合物，是由黃曲霉、寄生曲霉和特曲霉產生的次級代謝產物，常存在于發霉的糧油食品與飼料中，其中以花生和玉米最為嚴重［1］。黃曲霉毒素在其結構上共同的特征是含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮。迄今為止，已經發現B1、B2、G1、G2、M1、M2等十幾種。其中，黃曲霉毒素B1被世界衛生組織癌癥研究機構列為I類致癌物［2］。世界各國對農產品和食品中AFB1的含量進行嚴格的控制。歐盟國家出臺了最為嚴格的限量標準為2.0μg／kg（在花生、堅果、干果和谷物中）。GB 2761—2011規定谷物、油脂及其制品中最大限量標準都是20μg／kg，嬰幼兒配方及輔助食品中限量標準為0.5μg／kg。因此建立檢測時間短、準確性高和靈敏度好的AFB1分析方法意義重大。

目前，檢測AFB1的方法主要有色譜法［3］、層析法［4］、生物傳感器法［5-6］、快速檢測卡法［7］等，這些方法各有優缺點，色譜法和層析法靈敏度高、精確度好，但存在儀器昂貴、步驟繁瑣等缺點。快速檢測卡法操作簡便、檢測快速，但檢測精度不足。電化學免疫傳感器通過將抗原／抗體間特異性免疫反應信號轉換為電信號，依據被測物不同濃度的信號變化構建相應數據模型，進行檢測。隨著特異性抗體不斷地被研發出來，免疫傳感器法正在迅速發展，電化學免疫傳感器法憑借其檢測靈敏度高和特異性好的優勢，也成為該毒素檢測的一種方法。

本研究以AFB1為研究對象，采用殼聚糖-金溶膠（CS-GNPs）復合膜修飾玻碳電極，將AFB1抗體與具有高比表面積、表面能和活性的金溶膠結合，制備了一種無標記的電流型免疫傳感器。利用該免疫傳感器成膜性極好且具有大比表面積的殼聚糖與具有良好生物兼容性的金溶膠有效固定抗體，利用小尺寸的金膠納米粒子（約20 nm）能給抗體蛋白質分子提供更自由取向的特點，增加抗體蛋白與金膠納米粒子的結合量，利用傳感器界面的電流變化與黃曲霉毒素的濃度成線性關系測定AFB1的濃度。本研究構建的免疫傳感器具有制備過程簡單，靈敏度高、檢出限低、穩定性好等優點，可應用于谷物食品、油脂中黃曲霉毒素B1的檢測。

1 試驗材料與方法

1.1 儀器與設備

LK98BⅡ型微機電化學分析系統：天津蘭力科化學電子高技術有限公司；三電極系統（3 mm玻碳圓盤電極為工作電極、鉑絲電極為對電極、Ag／AgCl電極為參比電極）、電解杯：上海CHI儀器公司；Multi-skan FC酶標儀：熱電公司。

1.2 材料與試劑

黃曲霉毒素B1標準溶液、抗體、黃曲霉毒素B1試劑盒：深圳芬德生物技術有限公司；檸檬酸三鈉（分析純）：北京精華耀邦醫藥科技有限公司；K3［Fe（CN）6］（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；花生油、玉米油、花生、玉米：市售。

1.3 方法

1.3.1 CS-GNPs復合膜的制備

準確稱取45 mg殼聚糖，溶解在4.5 mL體積分數為1%的醋酸溶液中，持續攪拌至無氣泡，制得1%殼聚糖儲備液，于4℃儲存。50 mL 1.0×10-4g／mL的氯金酸在100 r／min磁力攪拌下，加熱至沸騰，迅速加入0.01 g／mL 檸檬酸鈉水溶液2 mL，煮沸5 min，溶液顏色由灰-藍-紫，最后為酒紅色，移去熱源，攪拌10 min，冷卻到室溫，于4℃儲存。在制備金溶膠之前，所有的玻璃儀器都需要用新鮮的王水即HCl／HNO3＝3∶1 浸泡24 h，再用二次蒸餾水充分清洗干凈。將殼聚糖溶液和金溶膠溶液等體積的混合后，于4℃冰箱過夜后待用。

1.3.2 電化學免疫傳感器的制備

玻碳電極（GCE，直徑3 mm）用0.05μm的氧化鋁粉末仔細打磨拋光成鏡面，并先后于1∶1硝酸溶液，無水乙醇和去離子水中超聲1 min，最后將電極用氮氣吹干待用。將電極置于0.2 mol／L硫酸溶液用速度為50 mV／s、電壓為-1.0～1.0 V 的循環伏安法掃面約10 min，得到穩定的循環伏安圖后，取出，用去離子水洗凈，氮氣干燥后備用。

免疫傳感器的制備過程見圖1。取5μL的CS-GNPs溶液滴于GCE表面，在25℃室溫下自然晾干。之后將電極放入AFB1抗體中4℃孵育2 h。最后將電極于4℃下在1%的BSA／PBS（pH 7.4）溶液中浸泡30 min，已封閉活性基團，得到CS-GNPs修飾的電化學免疫傳感器，于4℃保存待用。

圖1 免疫傳感器的制備及免疫過程

1.4 電化學方法

電化學免疫傳感器在不同濃度的AFB1標準溶液中于37℃下孵育25 min后，采用三電極體系（裸玻碳電極、免疫傳感器或抗體-抗原復合電極為工作電極，Ag／AgCl標準電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極），以1.0 mmol／L 的K3［Fe（CN）6］+0.1 mol／L 的KCl+0.2 mol／L 的PBS（pH 7.0）為測試底液，利用循環伏安法（電壓：-0.2～0.6 V，掃描速度：50 mV／s）表征電極在修飾過程中不同階段的電化學特征，利用差分脈沖伏安法（初始電位0.6 V，終止電位-0.2 V，電位增量0.005 V，脈沖幅度0.05 V，脈沖寬度0.05 s，脈沖間隔0.3 s，）記錄峰電流值，并根據峰電流減量值與黃曲霉毒素B1濃度之間的關系建立數學模型關系。

1.5 樣品的處理方法

稱取2 g粉碎樣品或液體于50 mL離心管中，加8 mL正己烷和10 mL樣品提取液（70%甲醇，即甲醇∶去離子水＝ 7∶3（V／V），振蕩5 min，室溫4 000 r／min離心10 min；去除上層液體，取0.5 mL 下層液體加入0.5 mL去離子水混勻；取50μL進行分析。

2 結果與討論

2.1 金溶膠溶液的表征

為了探索本試驗所用納米金溶膠的特性，利用紫外-可見光分光光度計對金溶膠溶液進行多波長掃描，獲得金溶膠紫外-可見光吸收光譜，測定其最大吸收波長，吸收峰值和峰寬，如圖2所示。納米金溶膠對于光的吸收屬于等離子共振吸收，球狀粒子的等離子共振吸收是由高于費米能級的導帶中自由電子在交變磁場的偶極震蕩引起的，不同的偶極震蕩與粒子的粒徑大小有一定的關系。根據文獻報道［8-10］，當最大吸收波長穩定在520 nm左右，金溶膠顆粒的平均直徑為10 nm左右，顆粒形狀規則，分散性較好。

圖2 金納米粒子的紫外可見光譜

2.2 CS-GNPs／GCE修飾電極的電化學表征

在1.0 mmol／L K3［Fe（CN）6］+0.1 mol／L KCl+0.2 mol／L PBS（pH 7.0）的測試底液中，采用循環伏安法對裸玻碳（a）、CS／GCE（b）和CS-GNPs／GCE（c）3種電極的電化學性質進行了表征（圖3）。如圖所示，Fe（CN）63-／4-在裸玻碳電極上出現1對較好的氧化還原峰。當電極的表面修飾了殼聚糖后，修飾電極的氧化還原峰電流減少，這是由于殼聚糖的導電性不好，對電子在電極表面上傳遞起阻礙的作用。然而，金溶膠的引入明顯提高了電極的電化學響應，使CS-GNPs／GCE的氧化還原峰電流均增加，這是由于金膠納米粒子通過殼聚糖固定在電極的表面，即形成電子與電極之間電子傳遞的活性中心，金納米粒子相當于納米尺寸的微電極，可作為電子與裸電極之間的傳輸通道。3種電極根據Randles-Sevcik方程［11］，電極的電活性面積由公式求出。

式中：A為有效電極面積／cm2，Ip陽極峰電流（μA），D 為擴散系數（7.6 ×10-6cm2／s），n 為參與氧化還原反應的電子數（n＝1），γ為電位變化速率（0.05 V／s），C 為K3［Fe（CN）6］的濃度（1 mmol／L）。根據計算得，裸玻碳電極、CS／GCE和CS-GNPs／GCE 的電活性面積分別為0.076、0.053、0.083 cm2。可知，金溶膠的加入明顯地增加了電極的表面電活性面積，從而提高了免疫傳感器的靈敏度。

圖3 不同修飾電極的循環伏安圖

當修飾電極浸泡于AFB1抗體后，氧化還原峰的電流減少（圖4中a和b），這是由于帶正電荷的抗體蛋白通過靜電相互作用牢固的吸附在帶負電荷的的金膠納米粒子表面上，抗體的絕緣性阻礙了電極表面的電子傳遞，說明AFB1抗體已經成功固定在電極表面上。將此修飾電極繼續放入AFB1溶液中，anti-AFB1和AFB1發生了特異性結合生成免疫復合物，增加了電極表面的空間位阻，使探針Fe（CN的氧化還原峰電流進一步降低（如圖4中的b與c線），這表明anti-AFB1和AFB1的特異性免疫反應成功。

圖4 修飾電極免疫前后的循環伏安圖

將CS-GNPs／GCE修飾電極在不同掃描速率（20～120 mV／s）下做循環伏安掃描，如圖5所示，隨著掃描速度的增加，氧化還原峰的電流均增加，掃描得到的氧化峰和還原峰的電流值都分別與掃描速率的平方根成線性關系：氧化峰y＝-2.584 7x-1.617 3，線性相關系數R2＝ 0.994 0；還原峰y ＝3.626 4x-0.443 4，線性相關系數R2＝0.994 1。說明該電極反應受擴散過程控制。

圖5 電化學免疫傳感器在不同掃描速度下的循環伏安圖

2.3 試驗條件的優化

2.3.1 修飾膜的厚度

殼聚糖-金溶膠膜的不同厚度可能影響電子的傳遞，本試驗分別用2、5、8、12μL的修飾液滴涂在玻碳電極上，然后檢測電子在其表面上電流的大小。結果表明，電流一開始是逐漸增大的，當修飾膜材料的用量為5μL時，電流最大。然后隨著膜厚度的增加電流逐漸減少，可能由于修飾膜厚度過大影響了電子的傳遞速率，所以選擇修飾膜材料的用量為5μL。

2.3.2 溫育時間與溫度對免疫傳感器的影響

抗體與抗原溫育時間和溫度對免疫反應有重要的影響。為了選擇最佳的溫育時間，將電化學免疫傳感器放入1.0×10-9g／L AFB1溶液中，反應不同的時間，利用差分脈沖伏安法測定其響應電流的變化，如圖6中曲線a所示。在5～20 min范圍內電流的變化隨溫育時間的增大而減少，這也說明了抗原與抗體需要一定的時間才能形成穩定的免疫復合物。當反應達到25 min后，電流變化值不明顯，這表明固定的抗體與游離的抗原的結合達到一個飽和的狀態。通常溫度的升高可以加速免疫復合物的形成，但升高溫度的同時可能會使具有蛋白性質的抗原與抗體失活。所以在上述最佳溫育時間的條件下，研究溫育溫度在15～40℃范圍內對免疫反應的影響，如圖6中曲線b所示。在15～35℃范圍內，響應電流隨溫度升高而增大。在35℃時達到最大值，但當溫度高于35℃后，響應電流的值反而減少，原因是免疫復合層受到高溫的破壞，影響了免疫傳感器的性能。所以試驗選取35℃為最佳溫育溫度。

圖6 溫育時間和溫度對免疫傳感器DPV峰電流的影響

2.3.3 介質pH對免疫反應的影響

檢測底液的pH對檢測信號的峰電流有著重要的影響。不同的底液pH，將會導致相同條件下掃描的峰電流不同。當溶液的pH為7.0時，所得的檢測信號峰電流IP最大，表明在pH為7.0時，檢測體系能夠達到最高靈敏度，這可能是因為酸度過高或過低，抗體中部分基團的質子化或解離導致抗體活性下降所致。所以試驗選擇pH 7.0的PBS配制檢測體系溶液。

2.4 免疫傳感器對AFB1的差分脈沖響應檢測

配制系列濃度的AFB1標準溶液，按照1.5節的方法測得傳感器在不同濃度標準溶液中的差分脈沖響應電流值，以抗體與抗原結合前后電流差值為縱坐標，抗原濃度大小為橫坐標，以此來做標準曲線，如圖7所示。在0.1～1.1 ng／g之間時免疫反應電流IP值隨AFB1濃度的增大而減小，且IP值與CAFB1之間的關系滿足線性關系方程：IP＝-4.927 4x+15.108 ，線性相關系數R2＝0.991 2，其最低檢測限為0.05 ng／g（S／N ＝3）。

圖7 AFB1的濃度對免疫傳感器響應電流的影響

2.5 免疫傳感器的穩定性與重現性

將制備好的電化學免疫傳感器連續掃描20次，免疫響應電流響應僅下降3.5%。然后將其置于4℃密閉保存，用來檢測AFB1溶液，30天后檢測信號為第1天的87%，表明傳感器的壽命較好，可以保持一定的使用周期。

2.6 樣品中痕量AFB1的測定及加標回收試驗

按1.5方法處理，得到提取液，按照前面優化好的試驗條件，分別采用免疫傳感器法和酶聯免疫法（ELISA）為檢測方法檢測花生油、玉米油、花生和玉米4種樣品中AFB1的含量，2種方法的實測值分別為2.67、1.80、6.31、4.16 和2.55、1.73、6.25、4.11 ng／g。加標回收試驗的結果如表1所示，由表1可見2種檢測方法的結果基本一致，但免疫傳感器法檢測靈敏度優于ELISA法。

表1 樣品中AFB1含量的測定結果

3 結論

利用殼聚糖-金溶膠復合膜修飾玻碳電極，采用表面帶負電荷的金納米粒子的導電高分子膜以靜電相互作用使抗體蛋白牢固的吸附在電極的表面，制備了一種信號放大型的安培型黃曲霉毒素B1免疫傳感器，提高了AFB1檢測的靈敏度。該納米免疫傳感器利用成膜性極好的殼聚糖分散金膠納米粒子來固定抗體，金納米粒子相當于納米尺寸的微電極，可作為氧化還原蛋白質與裸電極之間的傳輸通道，提高了免疫傳感器的信號響應靈敏度；用殼聚糖分散金膠納米離子，不僅增大了黃曲霉毒素B1抗體在電化學免疫傳感器上的固載量，并且保證了免疫傳感器的穩定性。此外，該傳感器制作過程簡單、靈敏度高、穩定性好、特異性強、可以用于糧油食品中AFB1的快速、簡便、靈敏檢測。

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A Nano Immunosensor for Rapid Determination of Aflatoxin B1in Grain and Oil Food

Wang Ruixin Li Shuguo
（Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018）

Using modified chitosan as immobilizing materials，gold nano particles and aflatoxin B1antibody were embedded and immobilized to prepare signal-enlarging Nano immunosensor to establish the method of immunosensor

to determine aflatoxin B1in grain and oil food.Preparation conditions and determination parameters of Nano immunosensors were optimized；Based on the Specific immune reaction between antibody and antigen of AFB1，the effects of immune response on the immunosensor response current were investigated by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry using K3［Fe（CN）6］as the probe.The results showed that the immune response currents formed a linearl relationship with the concentration of aflatoxin B1in the range of 0.1 ～1.1 ng／g，its calibration curve equation was y ＝ -4.927 4x+15.108，R2＝0.991 2 with the lowest detection limit of 0.05 ng／g（S／N ＝3）；Excellent stability and reproducibility of the immunosensor were observed in the selected condition.The developed method was applied to the determination of aflatoxin B1in peanut oil，maize and maize oil samples，and the recovery rate was 87.8～98.2%.Being more precise and accurate than ELISA method，it was practicable for rapid determination of aflatoxin B1in grain and oil food with simple pretreatment.

aflatoxin B1，nano immunosensor，gold nanoparticles （GNPs），rapid determination，food safety

TS21

A

1003-0174（2016）11-0145-06

國家自然科學基金（20876165），河北省食品藥品安全科技項目計劃（PT2014027）

2015-03-23

王瑞鑫，男，1992年出生，碩士，食品科學與安全

李書國，男，1969年出生，教授，糧油食品安全技術