穗發芽抗性相關分子標記在73個小麥品種中的有效性評價

白宇皓，陳真真，談宏斌，刁慧珊，梁邦平，李家創，劉 洋，武 軍，趙繼新，楊群慧，陳新宏

(1.西北農林科技大學農學院/陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室，陜西楊凌 712100； 2.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州 034000； 3.陜西省種業集團有限責任公司，陜西楊凌 712100)

穗發芽抗性相關分子標記在73個小麥品種中的有效性評價

白宇皓1,2，陳真真1，談宏斌3，刁慧珊1，梁邦平1，李家創1，劉 洋1，武 軍1，趙繼新1，楊群慧1，陳新宏1

(1.西北農林科技大學農學院/陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室，陜西楊凌 712100； 2.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州 034000； 3.陜西省種業集團有限責任公司，陜西楊凌 712100)

為發掘小麥抗穗發芽種質資源，并對與抗穗發芽相關的分子標記的有效性進行驗證，對73個國內外小麥品種進行了穗發芽抗性鑒定，同時利用4對穗發芽抗性相關分子標記(Vp-1B3、wmc104、Xbarc170、Xgwm155)對上述品種進行PCR檢測。結果表明，73個品種的穗發芽抗性差異明顯，發芽指數變化范圍為0.29%～88.48%，其中13個品種的發芽指數小于10%。分析發芽指數與分子標記檢測結果之間的相關性表明，Vp-1B3標記與穗發芽抗性相關，wmc104、Xbarc170、Xgwm155標記與穗發芽抗性相關性不顯著。煙農23、蘭考181、陜農33、西農585、美105、美231、PBW550、DL788-2等8個品種為具有 Vp-1Bb基因型的高抗穗發芽品種。

小麥；穗發芽；發芽指數；分子標記

小麥在收獲前遇到潮濕陰雨天氣而在穗上發芽稱作成熟期穗發芽(pre-harvest sprouting,PHS)，發生穗發芽的小麥在產量、品質、加工價值上都相應下降，同時對下年的種子品質也有較大影響[1]。在我國，受小麥穗發芽影響的區域十分廣泛，長江中下游地區、西南冬麥區、東北春麥區、黃淮冬麥區等在小麥成熟期易出現連續陰雨的地區穗發芽發生較為嚴重。統計數據表明，受穗發芽影響的小麥種植面積占全國總小麥種植面積的83%[2]。因此，穗發芽抗性材料的發掘與抗穗發芽品種的選育是小麥抗性育種的重要課題之一。

穗發芽抗性的機理較為復雜，抗性性狀受到多種因素影響，其中種子自身因素包括種子休眠水平、種子結構、穗部形態、干燥能力等[3]；環境因素包括環境溫度、水分、光照、土壤氮含量等[4]。種子的休眠特性是影響穗發芽抗性的主要因素[5]，有一系列調控種子休眠的基因和QTL被定位到了小麥基因組染色體上。Groos等[6]用不抗穗發芽的白皮品種與抗穗發芽的紅皮品種雜交后構建連鎖圖譜，在控制種皮顏色的R基因和 taVp1基因位點附近定位了3個與穗發芽相關的QTL，位于第三同源群長臂上。Flintham等[7]將1個與休眠相關的主效基因Phs定位于4AL上，并分析了白皮小麥和紅皮小麥中近等R基因的差異與休眠水平的關系，解釋了紅皮小麥有較好的穗發芽抗性的原因。Chao等[8]在2A、2B、3A、4A和7B染色體上發現了與種子休眠和穗發芽抗性相關的基因，但同時認為穗發芽抗性受多基因控制且與種子休眠特性呈弱相關。Yang等[9]發現 Vp-1基因的等位變異 Vp-1B與穗發芽抗性相關，并開發出定位于3BL上的Vp-1B3標記。Vp-1B3標記對89份白皮小麥品種進行驗證，抗穗發芽品種可擴增出845 bp或569 bp片段，感穗發芽品種擴增出652 bp片段。Roy等[10]通過對分別由5個重組自交系構建的抗感池進行分離群體分組分析，發現定位于6B染色體上的STS標記wmc104與穗發芽抗性顯著相關。Mares等[11]在4A染色體上發現1個與種子休眠相關QTL，并證明位于其一側的SSR標記Xbarc170與種子休眠有關。Kulwal等[12]發現1個定位于3AL染色體上與種子休眠相關的主效QTL，與SSR標記Xgwm155緊密連鎖。

育種過程中應用分子標記輔助選擇技術能較為高效地對目標性狀進行選擇，但穗發芽抗性易受環境因素影響，且在基因水平上又受多基因位點調控，因此，已開發的標記對于其他不同遺傳背景的小麥的適用性和有效性還需要進一步檢驗，單一鑒定方法所得出的鑒定結果的可靠性也值得商榷。鑒于此，本研究采用籽粒鑒定法對73個小麥品種的穗發芽抗性進行鑒定，并選擇4對與穗發芽抗性相關的分子標記對上述品種進行檢驗。這4對分子標記分別定位于小麥4條染色體上，且均在一定范圍內進行過有效性驗證，其中Vp-1B3標記在已有報道中有效性驗證得到一致的結論，其他3對標記在不同的品種中的有效性需要進一步驗證。本研究進一步擴大驗證范圍，確定4對標記在實際應用中的適應性，以期篩選出能夠廣泛利用的穗發芽抗性標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的73份小麥品種遺傳背景較為廣泛，8份為美國品種，14份為印度品種，51份為國內品種(表2)，于2014年10月種植于西北農林科技大學楊凌小麥試驗示范基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 發芽指數測定

各小麥品種蠟熟期時取穗，自然干燥7 d后脫粒。籽粒經1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒后用無菌水沖洗干凈。將籽粒腹溝向下置于鋪有濕潤濾紙的培養皿內，25 ℃恒溫培養箱內發芽。第2天起記錄各品種每天發芽的籽粒數，以觀察到種皮明顯裂開作為發芽的標準[14]，觀察記錄7 d。每個品種設置3次重復，取3次重復的平均值作為各品種發芽指數(germination index,GI)。

GI =(7×N1+6×N2+5×N3+…+1×N7)/(7×籽粒總數)×100%

其中，N1至N7分別代表第1天至第7天籽粒的發芽數。

1.2.2 抗穗發芽分子標記檢測

采用CTAB法[15]提取73份供試材料葉片的基因組總DNA。選用Vp-1B3、wmc104和Xbarc170、Xgwm155四對穗發芽抗性分子標記(表1)進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、dNTPs 2 μL、Taq酶0.25 μL、模板DNA 100 ng，ddH2O補足至25 μL。Vp-1B3標記的PCR反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，36個循環；72 ℃ 10 min。Xbarc170和Xgwm155標記的PCR反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，36個循環；72 ℃ 10 min。wmc104標記的PCR反應程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，61 ℃ 1 min (每個循環降低0.25 ℃)，72 ℃ 2 min，36個循環；72 ℃ 10 min。Vp-1B3標記擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，wmc104、Xbarc170和Xgwm155標記擴增產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[16]。

表1 本研究選用的4對穗發芽抗性標記

Table 1 Four markers associated with pre-harvest sprouting resistance in this study

標記名稱Markername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')染色體Chromosome標記類型Markertype抗性條帶Resistantfragment參考文獻ReferenceVp-1B3F:TGCTCCTTTCCCAATTGG3BLSTS845bp/569bp[9]R:ACCCTCCTGCAGCTCATTGwmc104F:TCTCCCTCATTAGAGAGTTGTCCA6BSTMSβ[10]R:ATGCAAGTTTAGAGCAACACCAXbarc170F:CGCTTGACTTTGAATGGCTGAACA4ASSRC[11]R:CGCCCACTTTTTACCTAATCCTTTTGAAXgwm155F:CAATCATTTCCCCCTCCC3ALSSRc[12]R:AATCATTGGAAATCCATATGCC

1.2.3 數據統計分析

用SPSS 23.0對試驗數據進行統計及單因素ANOVA檢驗。

2 結果與分析

2.1 73個品種穗發芽抗性表現

73個品種按GI值可分為4類，高抗(GI<10%)、中抗(10%60%)，其中，高抗品種13個，包括美215、美105、美114、美231、HD2932、PBW550、UP2338、煙農23、淮核09182、蘭考181、陜農33、周麥24、西農585，平均GI值為4.72%，變異范圍為0.29%～9.62%；中抗品種32個，平均GI值為21.14%，變異范圍為10.19%～28.95%；中感品種20個，平均GI值為42.96%，變異范圍為30.38%～58.48%；高感品種8個，平均GI值為72.44%，變異范圍為61.81%～88.48%。

2.2 4對穗發芽抗性相關分子標記的有效性

2.2.1 STS標記Vp-1B3的有效性

73個品種中有68個品種用Vp-1B3標記可擴增出569 bp或652 bp兩種類型的產物，分別是抗穗發芽和感穗發芽品種的特異性產物。其中，可擴增出569 bp產物的品種有31個，平均GI值為19.34%，變異范圍為1.90%～61.81%；可擴增出652 bp產物的品種有37個，平均GI值為37.54%，變異范圍為0.29%～88.48%。5個品種沒有擴增出這2個類型的產物。圖1為部分品種擴增產物的電泳檢測結果。方差分析表明，檢測出這2類產物的品種之間GI值的差異達到顯著水平(F=16.60，P=0.000 1)。

2.2.2 STMS標記wmc104的有效性

73個品種中有69個品種用wmc104標記可擴增出α、β、γ、δ四種類型產物中的一種，β型擴增產物是抗穗發芽品種的特異性產物，α、γ、δ三種類型產物是感穗發芽品種的特異性產物。其中，可擴增出α型產物的品種13個，平均GI值為26.93%，變異范圍為0.29%～72.10%；擴增出β型產物的品種34個，平均GI值為32.33%，變異范圍為3.05%～69.81%；擴增出γ型產物的品種16個，平均GI值為32.17%，變異范圍為1.90%～88.48%；擴增出δ型產物的品種6個，平均GI值為19.86%，變異范圍為2.38%～32.00%。4個品種沒有擴增出這4個類型的產物。圖2為部分品種擴增產物的電泳檢測結果。方差分析表明，檢測出這4類產物的品種之間GI值的差異沒有達到顯著水平(P=0.49)。

M：DL2000；1：小偃503；2：蘭考7號；3：周麥18；4：西農8006；5：西農9871；6：西農3517；7：西農2000；8：美6；9：美105；10：美231；11：PBW343；12：DBW-17。

M:DL2000;1:Xiaoyan 503;2:Lankao 7;3:Zhoumai 18;4:Xinong 8006;5:Xinong 9871;6:Xinong 3517;7:Xinong 2000;8:Mei 6;9:Mei 105;10:Mei 231;11:PBW343;12:DBW-17.

圖1 VP-1B3標記擴增出的兩種片段類型

Fig.1 Two types of fragments amplified by Vp-1B3 marker

1：小偃503；2：蘭考7號；3：周麥18；4：西農8006；5：西農9871；6：西農3517；7：西農2000；8：中育9037；9：鄭0856。

1:Xiaoyan 503;2:Lankao 7;3:Zhoumai 18;4:Xinong 8006;5:Xinong 9871;6:Xinong 3517;7:Xinong 2000;8:Zhongyu 9037;9:Zheng 0856.

圖2 分子標記wmc104擴增出的四種片段類型

Fig.2 Four types of fragments amplified by wmc104 marker

2.2.3 SSR標記Xbarc170的有效性

有63個品種用Xbarc170標記可擴增出A、B、C、D、E五種類型產物之一，C型產物是抗穗發芽品種的特異性產物，A、B、D、E型產物是感穗發芽品種的特異性產物。其中，可擴增出A型產物的品種2個，平均GI值為26.62%，變異范圍為12.57%～40.67%；擴增出B型產物的品種11個，平均GI值為35.19%，變異范圍為6.57%～79.71%；擴增出C型產物的品種28個，平均GI值為24.88%，變異范圍為2.38%～88.48%；擴增出D型產物的品種10個，平均GI值為24.43%，變異范圍為0.29%～45.81%；擴增出E型產物的品種12個，平均GI值為35.90%，變異范圍為3.71%～72.10%。10個品種沒有擴增出這5個類型的產物。圖3為部分品種擴增產物的電泳檢測結果。方差分析表明，檢測出這5類產物的品種之間GI值的差異沒有達到顯著水平(P=0.38)。

1：陜農156；2：美6；3：美32；4：美105；5：美114；6：美129；7：美142；8：美215；9：美231；10：LOK-1；11：9W-273。

1:Shannong 156;2:Mei 6;3:Mei 32;4:Mei 105;5:Mei 114;6:Mei 129;7:Mei 142;8:Mei 215;9:Mei 231;10:LOK-1;11:9W-273.

圖3 Xbarc170標記擴增出的五種片段類型

Fig.3 Five types of fragments amplified by Xbarc170

2.2.4 SSR標記Xgwm155的有效性

有68個品種用Xgwm155標記可擴增出a、b、c、d四種類型的產物之一，c型產物是抗穗發芽品種的特異性產物，a、b、d型產物是感穗發芽品種的特異性產物。其中，可擴增出a型產物的品種18個，平均GI值為27.25%，變異范圍為9.24%～88.48%；擴增出b型產物的品種30個，平均GI值為27.57%，變異范圍為0.29%～65.24%；擴增出c型產物的品種10個，平均GI值為47.03%，變異范圍為16.19%～79.71%；擴增出d型產物的品種10個，平均GI值為28.96%，變異范圍為3.05%～61.81%。5個品種沒有擴增出這4個類型的產物。圖4為部分品種擴增產物的電泳檢測結果。方差分析表明，檢測出這4類產物的品種之間GI值的差異沒有達到顯著水平(P=0.26)。

1：小偃503；2：蘭考7號；3：周麥18；4：西農8006；5：西農9871；6：西農3517；7：西農2000；8：中育9037；9：鄭0856。

1:Xiaoyan 503;2:Lankao 7;3:Zhoumai 18;4:Xinong 8006;5:Xinong 9871;6:Xinong 3517;7:Xinong 2000;8:Zhongyu 9037;9:Zheng 0856.

圖4 Xgwm155標記擴增出的四種片段類型

Fig.4 Four types of fragments amplified by Xgwm155 marker

表2 73個品種的發芽指數和4對抗性標記檢測結果

Table 2 Germination index(GI) and the results of four markers detected in 73 cultivars

品種Variety發芽指數GI/%VP-1B3Xbarc170Xgwm155wmc104美215 Mei2150.29652Dbα淮核09182 Huaihe091821.71----蘭考181 Lankao1811.90569--γ煙農23 Yannong232.38569Cbδ陜農33 Shaannong333.05569Cdβ周麥24 Zhoumai243.71652Edα美105 Mei1053.71569Db-西農585 Xinong5854.76569CbαHD29324.95652Cbγ美114 Mei1146.57652B-β美231 Mei2319.24569Ba-PBW5509.43569CaβUP23389.62569Caβ小偃23 Xiaoyan2310.19652E-γDL788-210.38569CbβWH-14710.86569CbβRAJ-307711.24569DaβLOK-I12.57652Abα周麥18 Zhoumai1815.14652Baγ新麥26 Xinmai2616.19652Ccδ美129 Mei12916.38569Baα西農9871 Xinong987118.00569-aδUP-256519.05569Caβ新麥20 Xinmai2019.71569-cβ9W-27319.81569Caβ周麥30 Zhoumai3020.95569Edγ周麥25 Zhoumai2521.81569Caβ蘭考7號 Lankao722.38569Caγ鄭麥0856 Zhengmai085623.05652CbαDBW-1723.14569Cbγ農大1108 Nongda110823.52569Cdβ小偃503 Xiaoyan50323.71569Bdα綿1006-8 Mian1006-823.81652Dbβ煙19 Yan1924.10-Caβ中麥895 Zhongmai89524.29652Cbβ小偃22 Xiaoyan2224.57652Cbδ中育9037 Zhongyu903725.05569EcαDBW-1425.05-Cbγ武農6號 Wunong625.14569Cbβ豐德存麥5號 Fengdecunmai526.00569-bδ山農055843 Shannong05584327.24569Dbγ周麥16 Zhoumai1627.62652Eaγ洛麥23 Luomai2327.81569Cbβ西農223 Xinong22328.67569Ebβ西農889 Xinong88928.95652Dbγ西農8006 Xinong800630.38652Dbβ蘭考815 Lankao81530.95652-dα阜麥12 Fumai1232.00569Cbδ鄭0856 Zheng085634.76652Ecα西農3517 Xinong351735.14652Dbβ豫農88 Yunong8837.52652Edβ小偃120 Xiaoyan12037.71652Dbβ美32 Mei3237.81652Baβ百農416 Bainong41638.10652Cdγ

(續表2 Continued table 2)

品種Variety發芽指數GI/%VP-1B3Xbarc170Xgwm155wmc104周27 Zhou2738.76652Baβ陜農56 Shaannong5640.67569Acβ中2210 Zhong221044.19652Cbγ煙22 Yan2245.81652Daβ陜農156 Shaannong15646.29652Edβ浚麥35 Xunmai3548.57652Bcα徐麥9158 Xumai915854.19652Ebα西農2000 Xinong200055.33652Bbβ美6 Mei655.90652BaβDBW-1656.67652Cbγ山農22 Shannong2258.48--bβ浚麥K8 XunmaiK861.81569Cdβ鄭麥111 Zhengmai11163.71652-cβNIAW-3465.24652-bβ小偃24 Xiaoyan2469.81652Ecβ小偃18 Xiaoyan1872.10652Ecα美142 Mei14278.67----偃麥6號 Yanmai679.71652BcγPBW34388.48652Caγ

-表示沒有檢測到相應的擴增產物。

- indicated no specific products were detected.

3 討 論

穗發芽的抗性是一個受多因素影響的復雜性狀，與種子自身因素和環境因素均有密切關系，種子在萌發時α-淀粉酶活力、ABA含量、GA含量等也與穗發芽和種子休眠特性密切相關[17]。基因水平上受微效多基因和主基因的共同作用，抗性機理十分復雜。

目前雖然已經開發出很多與抗穗發芽或種子休眠相關的分子標記，但能應用到實際育種環節中的分子標記很少，一方面因為某些標記在篩選過程中應用了特定遺傳背景的品種或品系，且大多數標記是基于某個數量性狀位點開發[6-7]，而穗發芽抗性受多基因控制，在其他遺傳背景品種中這些標記的有效性有待進一步驗證；另一方面，許多標記基于材料的非休眠特性開發[10]，如種皮顏色、穗部形態等，在其他背景的材料中對種子休眠特性或穗發芽抗性做有效驗證的結果并不可靠。如本研究中采用的wmc104標記，是通過感穗發芽的白皮小麥和抗穗發芽的紅皮小麥品種雜交所構建的重組自交系中篩選出的，Roy等[10]認為其與穗發芽抗性有顯著相關性。張兆萍等[18]對309份小麥品種進行分析后表明，wmc104標記與穗發芽抗性有相關性，可以用于穗發芽抗性篩選，但楊 燕等[19]認為其與穗發芽抗性無關。本研結究中該標記與穗發芽抗性沒有顯著相關性，可能由于標記開發所用材料與驗證材料遺傳背景差異較大，或者因為穗發芽抗性的表達是多基因間互作的結果，單一位點的分子標記檢測無法解釋表型變異。可通過增加不同位點的其他分子標記進行驗證，即綜合多位點分子標記驗證對品種穗發芽抗性進行綜合評價，需要做進一步研究。

Xbarc170標記經驗證與穗發芽抗性無關，可能因為開發標記所用材料穗發芽抗性的表達是相應的QTL與其他基因間互作的結果，不適合對基因型差異較大的其他品種進行篩選。此外，各品種的田間生育期不完全一致，在蠟熟期取穗時所處生育期不能做到完全相同，對于種子休眠特性的影響需要做進一步的研究。

Xgwm155標記是由Kulwal等[12]發現的與1個抗穗發芽主效QTL緊密連鎖的分子標記，并且在6個不同環境條件下得到有效性驗證，但在本研究中其與穗發芽抗性相關性不顯著，其有效性還需要進一步驗證。

Yang等[9]開發的Vp-1B3標記可以檢測出含有 Vp-1B基因等位變異的 Vp-1Ba、 Vp-1Bb、 Vp-1Bc三種基因型，其中 Vp-1Bb基因型對穗發芽有較高抗性。 Vp-1基因是調控種子成熟、休眠的重要基因[20]。三種基因型表現出不同的穗發芽抗性可能與Vp-1蛋白轉錄本的量有關。本研究的結果表明，Vp-1B3標記的有效性得到驗證，并篩選出煙農23、蘭考181、陜農33、西農585、美105、美231、PBW550、DL788-2等8個品種，均為具有 Vp-1Bb基因型的高抗穗發芽品種，可作為穗發芽抗性育種中的重要種質資源。

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Validation of Molecular Markers Associated with Pre-harvest Sprouting Tolerance in 73 Wheat Cultivars

BAI Yuhao1,2，CHEN Zhenzhen1，TAN Hongbin3,DIAO Huishan1，LIANG Bangping1，LI Jiachuang1，LIU Yang1，WU Jun1，ZHAO Jixin1，YANG Qunhui1，CHEN Xinhong1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University/Shaanxi Key Laboratory of Plant Genetic Engineering Breeding,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Maize Research Institute,Shanxi Academy of Agricultrue Sciences,Xinzhou,Shanxi 034000,China;3.Shaanxi Seed Industry Group Co.,Ltd.,Yangling,Shaanxi 712100,China)

In order to select germplasms with pre-harvest sprouting (PHS) tolerance in wheat and validate the effectiveness of correlated markers,73 domestic and overseas wheat varieties including eight American varieties,14 Indian varieties and 51 Chinese varieties were evaluated by seed germination index (GI) and four molecular markers (Vp-1B3,wmc104,Xbarc170,Xgwm155) associated with PHS tolerance. The correlation between the PCR amplification results and GI among 73 varieties was analyzed by one-way ANOVA test and the result showed that significant difference in seed GI was found among these varieties mentioned above,with a range between 0.29% and 88.48%. Thirteen varieties have GI lower than 10%,which can be categorized as high resistant varieties. STS marker Vp-1B3 was significantly correlated with PHS tolerance. Other three markers were not related to PHS resistant in this study. Eight wheat varieties (Yannong 23,Lankao 181,Shannong 33,Xinong 585,Mei 105,Mei 231,PBW550 and DL788-2) have GI lower than 10% and were detected as high resistant varieties with Vp-1Bb gene by using PCR amplification method. The effectiveness of STS marker Vp-1B3 was validated and can be used to select PHS resistant varieties.

Wheat;Pre-harvest sprouting;Germination index (GI);Molecular marker

時間：2016-11-04

2016-05-08

2016-10-15

國家自然科學基金項目(31571650)；西北農林科技大學唐仲英育種基金項目

E-mail:byh@nwsuaf.edu.cn

陳新宏(E-mail:cxh2089@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)11-1449-07

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161104.0924.010.html