牛樟芝菌絲體和子實體三萜含量測定及Se和Mvd基因表達分析

李 晶，林雄杰，何靜敏，蔡 璨，林占熺*

(1. 國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；2. 福建省農業科學院果樹研究所，福建 福州 350013；3.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002)

牛樟芝菌絲體和子實體三萜含量測定及Se和Mvd基因表達分析

李 晶1,3，林雄杰2，何靜敏3，蔡 璨3，林占熺1,3*

(1. 國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；2. 福建省農業科學院果樹研究所，福建 福州 350013；3.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002)

為探討牛樟芝子實體和不同培養時期的菌絲體中三萜含量及鯊烯環氧酶基因(Se)和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因(Mvd)的表達情況，采用香草醛-冰醋酸法測定菌絲體和子實體的三萜含量，并利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析甲羥戊酸途徑(MVA)中Se和Mvd基因表達水平。結果表明，隨著培養時間的推移，當生長至21 d時牛樟芝菌絲體干重逐漸趨于穩定。當培養時間小于28 d時，菌絲體中三萜含量隨著培養時間的延長而逐漸增加，且28 d時菌絲體的三萜含量最高，達(39.192±2.025)mg/g，僅次于牛樟芝子實體三萜含量(49.391±2.675)mg/g，玉米芯栽培的牛樟芝子實體三萜含量最低，為(11.530±0.733)mg/g，各樣品間三萜含量差異達到顯著水平(P<0.05)。qRT-PCR分析結果表明，培養7 d的菌絲體中Se和Mvd的表達量均為最高，但隨著培養時間的繼續延長而呈現下降趨勢；牛樟芝子實體中Se和Mvd的表達量均較低，與培養28～42 d的菌絲體表達量相當。本研究結果表明牛樟芝的三萜含量可能與其合成途徑中相關基因的表達量、培養條件和累積時間有關。

三萜；實時熒光定量PCR；鯊烯環氧酶；甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶

牛樟芝(Antrodiacinnamomea,A.cinnamomea)最早發現于我國臺灣，是當地特有的珍稀藥用菌品種，屬擔子菌門(Basidiomycota)、多孔菌目(Polyporales)、白肉迷孔菌科(Fomitopsidaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)，野生牛樟芝子實體生長在腐爛空心的牛樟樹(Cinnamomumkanehirai)內壁[1]。牛樟芝具有圓柱形的擔孢子，菌絲呈棕黃色或至紅色，子實體呈棕紅色，具有馬蹄狀或不規則狀。研究發現牛樟芝子實體、菌絲體和發酵液中都存在大量的三萜類化合物，它對酒精肝損傷有保護作用[2-3]。三萜類化合物(triterpenoids)是自然界中常見的一類天然產物，在藥用真菌、藥用植物中大量存在[4-5]。研究表明，三萜類化合物的生物合成途徑主要有甲羥戊酸途徑(mevalonic pathway, MVA)和脫氧木糖磷酸酯途徑(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway, DXP)[6-7]。Lu等[8]通過基因組和轉錄組測序技術揭示了三萜類化合物生物合成的MVA途徑及各種酶在途徑中的位置和作用，同時還發現牛樟芝子實體和菌絲體中的三萜成分并不相同，如antrocamphins僅存在于菌絲體中，麥角甾烷類僅存在于子實體中，而羊毛甾醇類在子實體和菌絲體中均存在，并且牛樟芝中三萜合成途徑與靈芝三萜合成途徑相似。早期研究者已成功克隆靈芝三萜合成途徑中多種關鍵酶、限速酶，包括3-羥基-3-甲基戊二酸單酰CoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR)[9]，法呢酯焦磷酸合酶(famesyl diphosphate synthase，FPS)[10]，鯊烯合酶(squalene synthase，SQS)[11]和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(Mevalonate pyrophosphate decarboxylase，MVD)等[12-13]，并證實這些酶在三萜合成過程中起到關鍵的作用。牛樟芝三萜合成途徑中香葉基焦磷酸合酶，(Geranyl diphosphate synthase, GPP)和法尼基焦磷酸合成酶(Farnesyl diphosphate synthase，FPP)是合成三萜類化合物的重要底物[8]，其中參與GPP合成的催化酶為甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(Mevalonate pyrophosphate decarboxylase，MVD)；而鯊烯環氧酶(squalene synthase，SE)則是牛樟芝三萜途徑中最后一步關鍵的限速酶，催化鯊烯(Squalene)合成2,3-氧化角鯊烯(2,3-oxido squalene)，從而合成羊毛甾醇等物質。

牛樟芝子實體在人工和自然條件下生長極緩慢，但牛樟芝中三萜類化合物顯著的藥理作用讓其在國內外受到消費者青睞，而液體發酵技術是較常見的真菌培養技術[14-15]，因此利用液體培養牛樟芝菌絲體逐漸成為解決牛樟芝市場產業化發展的主要方法之一。為進一步探討牛樟芝在液體發酵培養菌絲體的不同時期三萜含量的變化和菌絲體中鯊烯環氧酶基因(Se)和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因(Mvd)表達量的關系，通過實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測不同培養時期的牛樟芝菌絲體和子實體中Se和Mvd的表達情況，為探究牛樟芝菌絲體中三萜合成的重要機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

牛樟芝菌株AC001(GenBank NO.：KM925002)、牛樟木栽培牛樟芝子實體(36個月)(ACFB-CK)、玉米芯栽培牛樟芝子實體(36個月)(ACFB-CC)均由臺灣神農真菌生物技術有限公司惠贈，保存于國家菌草工程技術研究中心。

1.2 主要試劑及引物

TRIzol試劑購于Invitrogen公司，Reverse Transferation試劑盒購于TOYOBO公司，膠回收試劑盒購于OMEGA公司，SYBR Premix ExTaqTM、Easy dilution，E.coliDH5α感受態細胞和pMDTM18-T載體購于Takara公司，高保真酶HiFiTaqMix購于Genstar公司，齊墩果酸購于福建省藥品檢驗所，葡萄糖、冰醋酸、香草醛、高氯酸等均為分析純，購自國藥集團。

參照已克隆的牛樟芝Se(GenBank No.：KT070558)和Mvd(GenBank No.：KR364808)基因的mRNA保守區序列設計qRT-PCR引物，所涉及引物均由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成(表1)。

1.3 方法

1.3.1 牛樟芝菌絲體液體培養 挑取在PDA培養基上活化好的牛樟芝菌種，將其切成0.5 cm × 0.5 cm大小的菌塊，接種至100 mL滅菌后的基礎培養基(葡萄糖25 g/L，蛋白胨5 g/L，麥芽糖3 g/L)中振蕩培養14 d后作為液體菌種，按3 %的比例將其接種到牛樟芝液體培養基GPM中，28 ℃，120 r/min，黑暗培養7、14、21、28、35和42 d后備用。

1.3.2 牛樟芝菌絲體及子實體三萜含量測定 收集上述培養7、14、21、28、35和42 d的新鮮菌絲體和ACFB-CK、ACFB-CC新鮮子實體，分別在55 ℃條件下烘干至恒重，參考陸震鳴的三萜提取方法[15]，分別稱取粉碎好的牛樟芝菌絲體及子實體粉末0.5g，按料液比1∶40(w/v)的比例加入80 %乙醇，作為提取溶劑，70 ℃超聲提取1 h，重復提取1次，將2次的提取液合并，過濾，濃縮，離心后取上清液并定容到50 mL。

表1 qRT-PCR引物

稱取干燥至恒重的齊墩果酸標準品10.08 mg于25 mL容量瓶中，用80 %乙醇溶解并定容，其終濃度為0.4032 mg/mL。精確吸取齊墩果酸標準品溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80 mL至刻度試管中，置于50～60 ℃的水浴中，待溶劑蒸干后分別加入0.3 mL 5 %香草醛-冰醋酸溶液和1 mL的高氯酸，60 ℃水浴反應20 min，冰水冷卻后加入10 mL冰醋酸，搖勻后，以空白為對照，于300～800 nm掃描確定最大吸光值，以齊墩果酸濃度(mg/g)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程。

取待測樣品溶液0.5 mL按上述操作方法測定其吸光值，分別計算其三萜含量， ACFB-CK設為對照。

1.3.3 牛樟芝菌絲體及子實體RNA提取及cDNA合成 收集上述培養7、14、21、28、35和42 d的新鮮菌絲，ACFB-CK和ACFB-CC新鮮子實體，分別采用TRIzol法提取RNA[17]，經1 %瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop C2000進行純度和濃度測定合格后，按Reverse Transferation試劑盒使用說明進行cDNA的合成，反應體系為20 μl，每管含RNA樣品500 ng。

1.3.4 重組質粒熒光定量PCR標準曲線建立 利用高保真HiFiTaqMix從牛樟芝的cDNA分別擴增Se和Mvd基因，目的片段經0.8 %瓊脂糖凝膠回收，加A尾后進行TA克隆，挑取經菌液PCR驗證的單克隆擴大培養后提取重組質粒。將該質粒按10倍梯度稀釋，共稀釋5個濃度，再分別以稀釋后的質粒為模板，用表1的引物分別進行qRT-PCR擴增，根據公式Eq. 1計算重組質粒DNA中基因拷貝數，以基因拷貝數的對數值(Log Starting quantity，LogSQ)為橫坐標(X)，以測定的Cq值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。

目的基因拷貝數(copies/μl)=6.02×1023×RNA濃度(ng/μl×10-9)/(目的DNA長度×660)(Eq. 1)

1.3.5 牛樟芝中Se和Mvd基因表達分析 采用SYBR熒光染料法，分別檢測牛樟芝菌絲體的不同時期及子實體中Se和Mvd基因的表達情況。PCR反應體系為20 μl，包括10 μl 2×SYBR Premix ExTaqTM，1 μl cDNA模板，上下游引物各1 μl和7 μl ddH2O。PCR反應條件為95 ℃ 3 min，39個循環95 ℃ 10 s，58.2/62.5 ℃ 40 s。以ddH2O代替cDNA為模板的為空白對照，按標準曲線形成公式及Eq.1計算基因拷貝數。

1.3.6 數據處理 每組樣品設3個重復，采用SPSS 20和Excel進行數據統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 不同培養時期的牛樟芝菌絲體生物量比較

牛樟芝菌絲體在液體培養基中，28 ℃，120 r/min，黑暗培養4～5 d后開始萌發，7 d后菌絲呈淡黃色的均勻圓球狀，菌絲體干重(Dry weight，DW)僅(0.239±0.029)g/100 mL；培養14 d后菌絲體呈乳白色圓球狀，菌絲體重(0.550±0.074)g/100 mL(DW)；培養21 d后菌絲體明顯增多，培養液由淡黃色轉變成金黃色，菌絲體重(0.840±0.059)g/100 mL(DW)；培養28 d后，菌絲球不再繼續生長，而是在瓶壁上長出環狀菌皮，培養液由金黃色逐漸變成深黃色，菌絲體重(0.826±0.098)g/100 mL(DW)；培養35 d后培養液由深黃色到橘黃色，菌絲球幾乎停止生長，菌絲體重(0.787±0.022)g/100 mL(DW)；當培養42 d后，菌絲體重(0.658±0.074)g/100 mL(DW)，培養液的顏色由淡黃色逐漸轉為棕紅色(圖1～2)。

2.2 牛樟芝子實體及不同生長時期菌絲體總三萜含量

牛樟芝子實體及液體培養的菌絲體收集干燥后進行總三萜的提取及含量測定。掃描結果表明，548 nm處為溶液最大吸收峰，牛樟芝菌絲體培養7、14、21、28、35和42 d后的總三萜含量分別為(15.170±1.400)、(17.574±2.015)、(26.400±2.259)、(39.192±2.025)、(28.907±0.619)和(30.074±0.684)mg/g。當培養時間小于28 d時，菌絲體的總三萜含量隨著培養時間的增加而增加，而當培養時間為28～42 d時，菌絲體三萜含量隨著培養時間的增加而下降，但培養42 d的牛樟芝菌絲體三萜含量略高于35 d。ACFB-CK和ACFB-CC的總三萜含量的測定結果表明，ACFB-CK的總三萜含量顯著高于ACFB-CC和菌絲體(P<0.05)，達(49.391±2.675)mg/g；而ACFB-CC的總三萜含量最低，僅為(11.530±0.733)mg/g。

圖1 液體培養牛樟芝不同生長時期的菌絲形態Fig.1 Mycelium morphology of A. cinnamomea culture in surbmerge medium during different stages

圖2 液體培養牛樟芝不同時期的菌絲體生物量(不同字母代表P<0.05)Fig.2 Biomass of mycelium of A. cinnamomea in surbmerge medium during different stages

圖3 牛樟芝子實體及液體培養不同生長時期菌絲體的總三萜含量(vs ACFB-CK “*”表示差異顯著，P<0.05)Fig.3 Triterpeniods content of A. cinnamomea foodbody and mycelium in surbmerge medium during different stages

2.3 qRT-PCR標準曲線制作

利用PCR分別擴增Se和Mvd基因，純化后連到pMDTM18-T載體上，經轉化，篩選和驗證后，用Easy dilution 10倍梯度稀釋后，采用優化的實時熒光定量PCR進行擴增，以測定的Cq值為縱坐標(Y)，以樣品拷貝數的對數值(Log Starting quantity)(LogSQ)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，根據標準曲線和Eq. 1計算待測樣品的基因拷貝數。由圖4可知，2條標準曲線均具有良好的線性關系，通過Excel作圖獲得Se基因的標準曲線方程為y=-3.4704x+47.231(R2=0.994)；Mvd基因的標準曲線方程為y=-3.1854x+43.264(R2=0.996)。

2.4 qRT-PCR擴增產物特異性

Se和Mvd基因PCR擴增的產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測無引物二聚體及其它非特異性擴增條帶，溶解曲線為單峰，且峰值單一，產物特異性良好(圖5)。

2.5 不同生長時期牛樟芝菌絲體中Se和Mvd基因表達量分析

通過qRT-PCR測定并分析液體培養牛樟芝不同生長階段和三萜合成途徑中2個重要的基因(Se和Mvd)的表達水平。由圖6可知，牛樟芝體內Se基因表達量略高于Mvd。液體培養7 d后的牛樟芝菌絲體中2個基因的表達量最高，但隨著培養時間的推移，Se和Mvd的基因表達量隨著牛樟芝菌絲體的生長發育不斷下降；而ACFB-CK和ACFB-CC中2個基因的表達量均較低(圖6)。

3 討論與結論

三萜類化合物結構復雜、種類多樣，大部分由30個碳原子或27個碳原子組成的萜類物質，目前所發現的品種有200余種[2, 18]。牛樟芝的苦味主要來自三萜類化合物，到目前牛樟芝子實體、菌絲體、發酵液中分離到的泛醌衍生物、馬來酸衍生物、三萜類化合物、生育酚等物質70余種，其中三萜類物質達30余種[19]，且被證實具有保肝[20]、抗氧化[21]等顯著效果，因此，提高三萜類化合物的合成效率和研究其形成的通路逐漸受到關注。

圖4 qRT-PCR標準曲線Fig.4 Standard curve obtained by plotting the starting copy numbers of recombinant plasmid against the cycle numbers

圖5 實時熒光定量溶解曲線Fig.5 Melting curves obtained by plotting fluorescence data against the cycle numbers

圖6 不同培養時間的牛樟芝菌絲體中Se和Mvd基因拷貝數(vs ACFB-CK “*”和“**”表示差異顯著，P<0.05)Fig.6 Se and Mvd gene copy numbers in A. cinnamomea mycelium under different culture time

牛樟芝中三萜合成途徑復雜，SE和MVD是已被證實在牛樟芝三萜合成途徑中是重要的催化酶[7]。Lu等[7]研究表明MVD催化甲羥戊酸-5-焦磷酸(Mevalonate-5PP)合成3-異戊烯基焦磷酸(Isopentenyl-PP)，是合成單萜化合物的底物。Se是三萜合成途徑中的關鍵酶，它催化鯊烯(Squalene)合成2,3-氧化角鯊烯(2,3-oxido squalene)，作為合成羊毛甾醇的主要底物。研究還表明，MVD催化的反應發生在SE催化反應之前，通過MVD催化形成的Isopentenyl-PP可分別經IDI和FPPS催化形成DMAPP和Farnesyl-PP，只有后者可通過鯊烯合酶(SQS)和SE進一步催化形成羊毛甾醇類三萜化合物，從而進一步證實MVD和SE所在酶促反應是羊毛甾醇類三萜化合物形成途徑中的關鍵反應，而Se和Mvd基因表達量的直接影響這兩個反應的進行，從而進一步影響羊毛甾醇類三萜化合物的含量。

通過對牛樟芝不同時期Se和Mvd兩個基因的表達量分析，結果表明培養7 d后的牛樟芝菌絲體中兩個基因都表現出較高的活性；而在菌絲體生長7～42 d時主要是合成MVD，從而大量積累Isopentenyl-PP用于生成單萜類化合物，所形成的單萜化合物可進一步經輔酶Q(CoQ)等催化形成安卓奎諾爾(Antroquinonol)和泛醌等化合物；而Isopentenyl-PP亦可通過SE的催化形成羊毛甾醇，羊毛甾醇是合成眾多三萜類化合物的重要底物，并通過細胞色素P450作用催化合成麥角甾烷類和羊毛甾醇類的三萜化合物。三萜類化合物種類繁多，在植物、真菌生長不同階段能大量產生和積累，培養7 d的牛樟芝菌絲體，細胞各方面活性較旺盛，Se和Mvd基因的表達量也相對最高；而ACFB-CK和ACFB-CC中的細胞生理活性上不如培養7 d的牛樟芝菌絲體，Se和Mvd表達量顯著低于培養7 d的菌絲體，但隨著生長時間的推移，ACFB-CK中三萜含量的積累卻遠高于其他時期，但隨著液體培養時間的延長，牛樟芝菌絲體中的三萜含量呈下降趨勢，其原因還有待研究。

研究還發現不同培養時間的牛樟芝菌絲體和牛樟芝子實體中Se和Mvd兩個基因的表達量與其三萜含量的變化趨勢并不一致。在菌絲體生長7～42 d時，Se的表達量始終高于Mvd可進一步推定SE催化反應發生在牛樟芝菌絲體形成的初期；而MVD催化的反應產物不僅用于合成三萜類化合物，同時還可生成Antroquinonol和泛醌等重要化合物質。對靈芝中MVD的研究發現其培養時間為12 d時，靈芝甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(Gl-mvd)的表達量最高，隨著時間的推移也逐漸下降，它與牛樟芝菌絲體中的研究結果相一致[13]。Han等[22]利用RNAi技術對人參中PgSE1和PgSE2進行沉默發現，人參三萜皂苷含量急劇下降，但PgSE2含量上調，甾醇含量增加，表明Se對甾醇和三萜皂苷的合成起到關鍵作用。

SE和MVD作為牛樟芝三萜合成途徑中2種重要的酶在不同的反應階段對三萜類化合物的合成起著重要的作用，而Se和Mvd基因的表達量與2種酶的活性直接相關，通過對不同培養時期的牛樟芝菌絲體中Se和Mvd基因的表達量的研究，進一步明確合成三萜類物質的影響因素，從而為促進牛樟芝菌絲體內三萜類化合物的合成奠定良好基礎。

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(責任編輯 李 潔)

Determination of Triterpenoids and Expression Analysis ofSeandMvdGene in Mycelium and Fruiting Body ofAntrodiacinnamomea

LI Jing1, 3, LIN Xiong-jie2, HE Jing-min3, CAI Can3, LIN Zhan-xi1, 3 *

(1.China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology, Fujian Fuzhou 350002, China; 2.Fruit Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fujian Fuzhou 350013, China; 3.School of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fujian Fuzhou 350002, China)

The relationship between triterpenoids content and squalene synthase gene (Se) and mevalonate pyrophosphate decarboxylase gene (Mvd) expression were analyzed during different culture stages ofAntrodiacinnamomea(A.cinnamomea) mycelium and fruiting bodies ofA.cinnamomea(ACFB-CK), which grew in the hay ofC.kanehiraeand the other one grew in corncob (ACFB-CC). Triterpenoids content of mycelium and fruiting bodies were detected by Vanillin-glacial acetic acid. The expressions ofSeandMvdgenes were detected using the quantitative Real-time PCR. The dry weight ofA.cinnamomeamycelium was increased gradually as incubation time was stable in culture for 21 days. The triterpenoids content ofA.cinnamomeain mycelium was gradually increased along with the culture time as the incubation time was less than 28 days, and it was the highest on the 28thday, which was (39.192±2.025)mg/g. It was next to the triterpenoids content of ACFB-CK (49.391±2.675)mg/g. The triterpenoids content of ACFB-CC was the lowest, which was only (11.530±0.733)mg/g. There was significant difference (P<0.05) between all the samples. It was showed in the qRT-PCR results that the expression ofMvdandSegenes was the highest inA.cinnamomeaon the 7thday, and it showed a declining trend as it submerged culture from 7 to 42 days. The expressions ofSeandMvdgenes were the highest in mycelium ofA.cinnamomeaon the 7thday in submerged culture. While the triterpenoids content in mycelium ofA.cinnamomeaon the 28thday in submerged culture was next to ACFB-CK. The triterpenoids content in ACFB-CC was the lowest. The expressions ofSeandMvdgenes in both ACFB-CK and ACFB-CC were low. They were almost the same as the expression of the mycelium which was in submerged culture for 28-42 days. The triterpenoids content was associated to the expression of the related genes in synthesis pathway of triterpenoids，the culture condition and accumulation time.

Triterpenoids; Quantitative Real-time PCR; Squalene synthase; Mevalonate pyrophosphate decarboxylase

1001-4829(2016)09-2206-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.033

2015-10-12

福建省菌草生態產業協同創新中心(K80ND8002)；福建農林大學科技發展基金(KF2015111)；國家菌草工程技術研究中心組建項目(2011FU125X12)

李 晶(1985-)，女，湖北武漢人，博士，蔬菜學專業食用菌方向，*為通訊作者，E-mail: lzxjuncao@163.com。

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