模擬微重力環(huán)境及普通環(huán)境下小球藻的培養(yǎng)

張志忍，王成成，王為國(guó)，汪鐵林，王存文

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430074

模擬微重力環(huán)境及普通環(huán)境下小球藻的培養(yǎng)

張志忍，王成成，王為國(guó)，汪鐵林*，王存文

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430074

利用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)模擬微重力場(chǎng)，考察模擬微重力場(chǎng)及添加不同質(zhì)量密度葡萄糖對(duì)小球藻（Chlorella sp.）生長(zhǎng)情況的影響.研究結(jié)果表明，以BG-11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，模擬微重力環(huán)境對(duì)小球藻生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用.當(dāng)小球藻細(xì)胞接種密度為1.42×107個(gè)/毫升，培養(yǎng)時(shí)間為12 d時(shí)，普通環(huán)境下培養(yǎng)的小球藻最高細(xì)胞密度僅為5.80×107個(gè)/毫升，而在相同培養(yǎng)條件下模擬微重力環(huán)境下生長(zhǎng)的小球藻細(xì)胞密度達(dá)到1.58×108個(gè)/毫升.在培養(yǎng)基中添加葡萄糖作為額外碳源后，微藻生長(zhǎng)周期顯著縮短，適宜小球藻生長(zhǎng)的葡萄糖質(zhì)量密度為10 g/L.當(dāng)添加10 g/L葡萄糖，小球藻接種密度為5.76×107個(gè)/毫升，培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)，普通環(huán)境和模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)的小球藻的最高細(xì)胞密度分別可達(dá)3.85×108個(gè)/毫升和5.42×108個(gè)/毫升.

模擬微重力；小球藻；葡萄糖

1 引言

由于對(duì)傳統(tǒng)化石能源的過分依賴，能源安全和氣候變化已成為當(dāng)今人類社會(huì)所關(guān)注的兩大熱點(diǎn)問題［1-2］.推行低碳經(jīng)濟(jì)已成為全球共識(shí)，生物質(zhì)能源的開發(fā)和利用已成為“后石油時(shí)代”世界能源發(fā)展戰(zhàn)略性轉(zhuǎn)變的方向.微藻生物質(zhì)與其他陸生生物質(zhì)相比，由于具有光合作用效率高、油脂含量高［3］、生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)速度快、生態(tài)分布廣［4］、不占耕地等優(yōu)勢(shì)，因此作為一種生物質(zhì)能源原料倍受關(guān)注.利用富油微藻不僅可以制取生物燃料，而且微藻在培養(yǎng)過程中還可以吸收大氣中的二氧化碳，有利于環(huán)境保護(hù).

篩選出大量?jī)?yōu)良的微藻品種是發(fā)展由微藻制取綠色生物質(zhì)能源的首要前提.已篩選出的微藻品種主要有斜生柵藻、葡萄藻、鹽生杜氏藻、小球藻、灰色念珠藻等，其中小球藻是一種公認(rèn)的大規(guī)模培養(yǎng)制備微藻燃料的優(yōu)良藻種.

能否大規(guī)模、高密度、低成本培養(yǎng)是制約富油微藻產(chǎn)業(yè)化的重要因素之一.近年來，為了加強(qiáng)對(duì)富油微藻生長(zhǎng)特性的了解，優(yōu)化其生長(zhǎng)條件，探索短耗時(shí)、低成本的培養(yǎng)途徑，已開展了關(guān)于光照強(qiáng)度、溫度、pH值、鹽度等環(huán)境因子影響微藻生長(zhǎng)的研究［5-9］.研究結(jié)果表明，若環(huán)境因子發(fā)生變動(dòng)，微藻會(huì)對(duì)其做出相應(yīng)的反應(yīng).改變培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基的類型、所添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類與含量、微藻生長(zhǎng)時(shí)的外界環(huán)境（如溫度、光照、pH值）等條件，都會(huì)使微藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生酶、藻蛋白、藻多糖、多不飽和脂肪酸（PUFAs）等物質(zhì)的能力受到影響［10］，進(jìn)而影響到微藻細(xì)胞密度和細(xì)胞組成.

微重力環(huán)境可能會(huì)對(duì)輪藻、杜氏鹽藻等微藻的代謝、發(fā)育、生殖、衰老等各方面生理生化過程產(chǎn)生影響［11-13］.太空飛行和地面回轉(zhuǎn)器的實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎說明，微重力改變了微藻機(jī)體與介質(zhì)環(huán)境的相互聯(lián)系，從而影響微藻的代謝.為探索高密度、短耗時(shí)的大規(guī)模微藻培養(yǎng)途徑，本研究以小球藻（Chlorella sp.）為培養(yǎng)對(duì)象，以BG-11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，利用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（the rotary cell culture system，RCCS）模擬微重力場(chǎng)，考察了模擬微重力場(chǎng)對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響，并在pH值、溫度、光照強(qiáng)度等培養(yǎng)條件相同的情況下，考察了添加不同濃度葡萄糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)中使用的微藻藻種是小球藻（Chlorella sp.），其編號(hào)為FACHB-9，由武漢水生生物所提供.采用BG-11培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純.

2.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見光分光光度儀（UV-6000，上海元析儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（美國(guó)Synthecon INC公司），二氧化碳人工氣候箱（LRH-300-GSIT，上海銀澤儀器設(shè)備有限公司），托馬細(xì)胞計(jì)數(shù)器（上海求精生化試劑儀器有限公司）.

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 小球藻的培養(yǎng)用經(jīng)過高壓滅菌后的BG-11培養(yǎng)基將處于成熟期的小球藻藻液稀釋10倍，再將藻液均分為多個(gè)組別，分別向其中添加不同濃度葡萄糖作為額外碳源后用于實(shí)驗(yàn).

將預(yù)處理后含不同濃度葡萄糖的藻液分別注入RCCS的回轉(zhuǎn)器中作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)將等體積的藻液注入100 mL的錐形瓶中作為對(duì)照組.將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組置于人工氣候箱中培養(yǎng)，每24 h測(cè)量一次細(xì)胞密度，以研究普通環(huán)境和微重力環(huán)境下小球藻的生長(zhǎng)情況.以上實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件均為：溫度（25±2）℃、冷白熒光光照強(qiáng)度4 000 lx/cm2、光照時(shí)間比12∶12.

2.3.2 藻液密度的測(cè)定藻液密度的測(cè)定采用分光光度法測(cè)量，采用UV-6000紫外-可見光分光光度計(jì)在680 nm波長(zhǎng)處測(cè)量藻液光密度（OD680，當(dāng)光密度大于1.0時(shí)適當(dāng)稀釋藻液），并采用托馬細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)量該藻液中的藻細(xì)胞數(shù)量.

2.3.3 比生長(zhǎng)速率的計(jì)算測(cè)出藻細(xì)胞密度后，再按公式（1）計(jì)算出特定時(shí)間內(nèi)的比生長(zhǎng)速率［14］.

式中K表示比生長(zhǎng)速率（d-1），N2、N1分別表示在T2和T1時(shí)刻的小球藻的細(xì)胞密度.

3 結(jié)果與討論

3.1 普通環(huán)境下葡萄糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)狀況的影響

細(xì)胞生長(zhǎng)過程中必須依靠碳源提供能量和組成碳骨架.大量研究表明，許多微藻均具有利用外加碳源進(jìn)行兼養(yǎng)及異養(yǎng)的能力.在微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)研究中，葡萄糖是一種廣泛采用有機(jī)碳源，其對(duì)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于碳酸氫鈉等無機(jī)碳源［15］.將初始藻液細(xì)胞密度為5.76×107個(gè)/毫升的小球藻在25℃、光照強(qiáng)度4 000 lx/cm2、光照比12∶12的普通環(huán)境下培養(yǎng)5 d.由圖1可知，添加了葡萄糖的實(shí)驗(yàn)組中微藻的生長(zhǎng)情況都較良好，最大藻細(xì)胞密度均超過3×108個(gè)/毫升，而沒有添加葡萄糖作為外加碳源的對(duì)照組中最大藻細(xì)胞密度僅為1.17×108個(gè)/毫升.

由圖1可以看出，在培養(yǎng)的第1 d，不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)微藻細(xì)胞濃度增長(zhǎng)均不明顯，此段時(shí)間可能是微藻生長(zhǎng)中對(duì)環(huán)境的一個(gè)適應(yīng)階段.但從第2 d開始，添加葡萄糖的實(shí)驗(yàn)組中微藻細(xì)胞的數(shù)量迅速增加，該生長(zhǎng)階段為小球藻的指數(shù)生長(zhǎng)期，在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到，藻細(xì)胞的體積增大并且藻體形態(tài)不一，此時(shí)對(duì)外界環(huán)境因子比較敏感.而與之相比，未添加葡萄糖的對(duì)照組中微藻的生長(zhǎng)緩慢，藻細(xì)胞濃度幾乎沒有表現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì).

微藻對(duì)葡萄糖的吸收利用可能存在兩種機(jī)制［16］：一種是低濃度下微藻的吸收就會(huì)達(dá)到飽和，在高濃度環(huán)境下微藻易死亡；另一種是較高濃度下微藻細(xì)胞吸收才能達(dá)到飽和.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量密度低于10 g/L時(shí)，小球藻最大比生長(zhǎng)速率隨葡萄糖質(zhì)量密度增加而明顯增加，但當(dāng)葡萄糖質(zhì)量密度處于10 g/L～20 g/L時(shí)，其最大比生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)反而隨葡萄糖質(zhì)量密度上升而下降，說明高濃度葡萄糖對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用，因此可以認(rèn)為小球藻對(duì)葡萄糖的吸收為第一種機(jī)制.

由圖1可知，添加葡萄糖作為額外碳源的小球藻在普通環(huán)境下均于第5 d進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，而未添加葡萄糖的對(duì)照組則保持緩慢的生長(zhǎng)速率，說明葡萄糖的添加顯著縮短了小球藻的生長(zhǎng)周期.7組不同處理組中5 g/L和10 g/L葡萄糖質(zhì)量密度的培養(yǎng)基的最大，比生長(zhǎng)速率分別達(dá)到1.71/d和1.73/d，并且添加質(zhì)量密度為10 g/L的葡萄糖時(shí)，最高藻細(xì)胞密度可達(dá)到3.85×108個(gè)/毫升，細(xì)胞生長(zhǎng)情況較其他濃度處理組都較好（見圖2），所以本實(shí)驗(yàn)確定普通環(huán)境下小球藻生長(zhǎng)的最適宜葡萄糖質(zhì)量密度為10 g/L.

圖1 普通環(huán)境下小球藻在含不同質(zhì)量密度葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線（接種藻密度5.76×107個(gè)/毫升，溫度25℃，光強(qiáng)4 000 lx/cm2，培養(yǎng)時(shí)間5 d）Fig.1Growth curves of C.sp.cultivated with different mass densities of glucose in general condition（the initial cell density=5.76×107cells/mL，temperature=25℃，illumination intensity=4 000 lx/cm2，culture time=5 d）

圖2 普通環(huán)境下小球藻在含不同質(zhì)量濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中的最大比生長(zhǎng)速率（接種藻密度5.76×107個(gè)/毫升，溫度25℃，光強(qiáng)4 000 lx/cm2，培養(yǎng)時(shí)間5 d）Fig.2Growth rates of C.sp.cultivated with different mass densities of glucose in the general condition（the initial cell density=5.76×107cells/mL，temperature=25℃，illumination intensity=4 000 lx/cm2，culture time=5 d）

3.2 模擬微重力環(huán)境下葡萄糖質(zhì)量密度對(duì)微藻生長(zhǎng)影響

自上世紀(jì)末就有實(shí)驗(yàn)表明螺旋藻等微藻在經(jīng)歷微重力環(huán)境后，藻細(xì)胞的存活率、生物代謝等多種特性均發(fā)生改變，尤其是藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率會(huì)明顯加快［17］.結(jié)合普通環(huán)境下葡萄糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)速率和細(xì)胞產(chǎn)量的明顯促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究在模擬微重力環(huán)境下加入不同質(zhì)量密度葡萄糖對(duì)微藻生長(zhǎng)情況所產(chǎn)生的影響.將初始藻液密度為5.76×107個(gè)/毫升的小球藻在25℃、光照強(qiáng)度4 000 lx/cm2、光照比12∶12的模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)5 d，生長(zhǎng)情況如圖3及圖4所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明添加葡萄糖后，微藻細(xì)胞濃度明顯增高.從圖3可以看出，隨著葡萄糖質(zhì)量密度的增高，獲得的藻細(xì)胞密度先增加，但當(dāng)葡萄糖密度過高時(shí)其藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率反而會(huì)有一定的下降.RCCS在轉(zhuǎn)動(dòng)的過程中使微藻能夠充分的與培養(yǎng)基接觸，吸收其中的養(yǎng)份，加快小球藻的生長(zhǎng)，同時(shí)高質(zhì)量濃度葡萄糖刺激微藻細(xì)胞大量繁殖快速代謝，但在有限的封閉生存環(huán)境中無法容納過大的生物量以及過高溶氧，致使細(xì)胞死亡，微藻生長(zhǎng)速率明顯下降.

圖3 模擬微重力環(huán)境下小球藻在不同質(zhì)量密度的葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況（接種藻密度5.76×107個(gè)/毫升，溫度25℃，光強(qiáng)4 000 lx/cm2，培養(yǎng)時(shí)間5 d）Fig.3Growth curves of C.sp.cultivated with different mass densities of glucose under the simulated microgravity condition（the initial cell density=5.76×107cells/mL，temperature=25℃，illumination intensity=4 000 lx/cm2，culture time=5 d）

圖4 模擬微重力環(huán)境下小球藻在不同質(zhì)量密度的葡萄糖培養(yǎng)基中的比生長(zhǎng)速率（接種藻密度5.76×107個(gè)/毫升，溫度25℃，光強(qiáng)4 000 lx/cm2，培養(yǎng)時(shí)間5 d）Fig.4Growth rates of C.sp.cultivated with different mass densities of glucose under the simulated microgravity conditions（the initial cell density=5.76×107cells/mL，temperature=25℃，illumination intensity=4 000 lx/cm2，culture time=5 d）

結(jié)合圖1以及圖3，可以看出在第1 d普通環(huán)境下微藻處于調(diào)節(jié)適應(yīng)期，生長(zhǎng)速率明顯低于第2 d的到第3 d的，而在模擬微重力環(huán)境下的微藻生長(zhǎng)并未進(jìn)入微藻調(diào)節(jié)適應(yīng)的階段.模擬微重力效應(yīng)反應(yīng)器的培養(yǎng)系統(tǒng)縮短了小球藻對(duì)高密度的葡萄糖培養(yǎng)基的適應(yīng)時(shí)間，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能在于小球藻在RCCS中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)隨回轉(zhuǎn)器繞水平軸不斷做圓周運(yùn)動(dòng)，在一個(gè)旋轉(zhuǎn)周期內(nèi)小球藻經(jīng)歷加速下降和減速上升等過程，導(dǎo)致藻細(xì)胞處于一個(gè)周期性超重和失重交錯(cuò)的變化重力場(chǎng)中，從而產(chǎn)生一個(gè)連續(xù)的自由落體狀態(tài)，使藻細(xì)胞表現(xiàn)出微重力下的生物效應(yīng).而RCCS產(chǎn)生的微重力效應(yīng)對(duì)微藻產(chǎn)生刺激，導(dǎo)致微藻生長(zhǎng)分化加速.這與劉永定等［18-19］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似.微藻在普通環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境是平衡的，而突然進(jìn)入微重力環(huán)境后，這種平衡被打破，微藻調(diào)節(jié)到新的微環(huán)境需要消耗能量，導(dǎo)致ATP酶活性增加并促使細(xì)胞自噬效應(yīng)提高，從而引起細(xì)胞分裂分化加速.

圖5和圖6進(jìn)一步對(duì)普通環(huán)境和微重力環(huán)境下小球藻生長(zhǎng)情況進(jìn)行對(duì)比.在同樣的接種濃度及未添加葡萄糖的條件下，培養(yǎng)12 d后普通環(huán)境下生長(zhǎng)的微藻細(xì)胞密度為5.8×107個(gè)/毫升，而模擬微重力環(huán)境下生長(zhǎng)的微藻細(xì)胞密度達(dá)1.58×108個(gè)/毫升.在不同環(huán)境條件下微藻細(xì)胞密度的生長(zhǎng)曲線都是隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)而逐步上升，并且無論添加葡萄糖與否，RCCS中生長(zhǎng)的微藻均表現(xiàn)出區(qū)別于普通環(huán)境下微藻的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì).除了模擬微重力生物學(xué)效應(yīng)，另外一個(gè)原因可能在于普通環(huán)境下藻細(xì)胞易在重力作用下沉降聚集在培養(yǎng)容器底部，從而抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng).而在模擬微重力環(huán)境下，藻細(xì)胞均勻懸浮于三維空間中，充分與培養(yǎng)基接觸，促進(jìn)藻細(xì)胞與培養(yǎng)基之間的物質(zhì)交換，提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率.

對(duì)比圖1和圖3可見微重力情況下添加10 g/L葡萄糖的小球藻在第3 d就達(dá)到了最高生物量，較普通環(huán)境下生長(zhǎng)的小球藻達(dá)到最高生物量縮短了2 d.同時(shí)在微重力環(huán)境下小球藻的最大藻細(xì)胞密度和最大比生長(zhǎng)率均高于普通環(huán)境下培養(yǎng)的小球藻.因此，模擬微重力環(huán)境時(shí)有利于微藻生長(zhǎng)，且在微重力環(huán)境下適合小球藻生長(zhǎng)的最適葡萄糖質(zhì)量密度約為10 g/L.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為小球藻的高密度、短耗時(shí)培養(yǎng)研究提供一定的依據(jù).

圖5 不添加葡萄糖的小球藻在微重力（SMG）與普通環(huán)境（GC）下的生長(zhǎng)曲線（接種藻密度1.423×107個(gè)/毫升，溫度25℃，光強(qiáng)4 000 lx/cm2，培養(yǎng)時(shí)間12 d）Fig.5Growth curves of C.sp.cultivated without glucose under the microgravity and general conditions（the initial cell density=1.423×107cells/mL，temperature=25℃，illumination intensity=4 000 lx/cm2，culture time=12 d）

圖6 小球藻在微重力環(huán)境（SMG）下及普通環(huán)境（GC）下生長(zhǎng)情況（10 g/L的葡萄糖）（接種藻密度5.76×107個(gè)/毫升，溫度25℃，光強(qiáng)4 000 lx/cm2，培養(yǎng)時(shí)間5 d）Fig.6Growth curves of C.sp.cultivated under the microgravity and general conditions in the medium with 10 g/L of glucose（the initial cell density=5.76×107cells/mL，temperature=25℃，illumination intensity=4 000 lx/cm2，culture time=5 d）

4 結(jié)語

分別對(duì)普通環(huán)境和模擬微重力環(huán)境下葡萄糖濃度對(duì)小球藻的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示不同濃度葡萄糖作為額外碳源在兩種環(huán)境下均明顯促進(jìn)了小球藻的生長(zhǎng)，縮短了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，使最高藻細(xì)胞密度顯著增加.并且兩種環(huán)境下，小球藻的最適葡萄糖質(zhì)量密度均為10 g/L.

模擬微重力環(huán)境對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用.在相同培養(yǎng)條件下，模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)的小球藻較普通環(huán)境生長(zhǎng)速度更快，藻細(xì)胞密度也更高.本研究結(jié)果可為小球藻高密度、短耗時(shí)的大規(guī)模培養(yǎng)提供一定的依據(jù).

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本文編輯：張瑞

Culture of Chlorella sp.in Simulated Microgravity and General Conditions

ZHANG Zhiren，WANG Chengcheng，WANG Weiguo，WANG Tielin*，WANG Cunwen
School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

The simulated microgravity condition was produced by the Rotary Cell Culture System to investigate effect of glucose mass density and simulated microgravity on the growth of Chlorella sp..The results show that the simulated microgravity has an obvious promotion effect on the growth of microalgae.The algae cell density under general environment is 5.80×107cells/mL when the initial cell density is 1.42×107cells/mL and culture time is 12 days，meanwhile the algae cell density under simulated microgravity condition can reach 1.58×108cells/mL.Furthermore，the microalgae growth circle is obviously shortened when glucose is added intotheculturemediumascarbonsource.TheoptimalglucosemassdensityfortheChlorellasp.growthis10g/L.When the initial cell density is 5.76×107cells/mL and culture time is 5 days，the maximum densities of microalgae cultured in simulated microgravity and general conditions reach 5.42×108cells/mL and 3.85×108cells/mL，respectively.

simulated microgravity；microalgae；glucose

Q949

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2016.06.002

1674-2869（2016）06-0521-06

2016-08-15

湖北省自然科學(xué)基金（2015CFB580）

張志忍，碩士研究生.E-mail：690940120@qq.com

*通訊作者：汪鐵林，博士，教授.E-mail：witwangtl@hotmail.com