桑樹SSR引物的開發(fā)及其多態(tài)性分析

摘要：利用FIASCO磁珠富集法開發(fā)出桑樹（Morus alba L.）基因組DNA的SSR位點引物46對，選出38對引物用于8份材料的多態(tài)性驗證。結(jié)果表明，38對SSR引物共擴增出清晰譜帶210條，不同引物的擴增條帶數(shù)1～12條，平均每對引物的擴增帶數(shù)為5.526 3條；每對引物組合可檢測到SSR多樣性位點數(shù)3～9個，共檢測到106個多樣性位點；所有位點的平均PIC值為0.645 8；8份供試材料在SSR水平上表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性差異，其中野生品種葫蘆桑和巖桑聚為Ⅰ組，遺傳距離為0.746 0，栽培品種垂桑、荷葉白、劍持、新一之瀨、倫教40、雞桑聚為Ⅱ組，劍持與荷葉白遺傳距離最近（0.169 5），親緣關(guān)系最近，葫蘆桑和巖桑與荷葉白的親緣關(guān)系最遠。

關(guān)鍵詞：桑樹（Morus alba L.）；SSR引物；多態(tài)性分析

中圖分類號：S888 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2824-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.028

桑樹（Morus alba L.）屬?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.），是蠶的優(yōu)良飼料，營養(yǎng)豐富。桑屬有許多種及變種，目前，中國有桑樹種質(zhì)資源3 000余份，包括15個桑樹種和4個變種，是世界上桑樹種最多的國家[1]。桑樹的分類基本上是依據(jù)花柱、柱頭內(nèi)側(cè)的狀況，以及枝、葉、花序和聚花果的大小、性狀等的形態(tài)特征進行，但有的性狀特征極易受到環(huán)境等非生物因素的影響，所以有時并不能真實反映桑樹種的親緣關(guān)系。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)標(biāo)記技術(shù)為物種鑒定、系統(tǒng)演化以及遺傳多樣性等的研究開辟了新的途徑。

DNA指紋技術(shù)是一種可檢測出大量DNA位點差異的分子生物學(xué)技術(shù)，在作物品種鑒定、品種注冊、純度檢測等方面具有重要作用[2]。SSR分子標(biāo)記近年來已被廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、大麥、大豆、棉花、玉米等作物資源分析、基因定位、雜種親本鑒定和純度分析[3-6]。彭波等[7]利用24對SSR引物（其中來自桑樹基因組的16對、無花果基因組的8對）對172個桑樹品種（系）進行研究，結(jié)果表明利用SSR對桑樹進行系統(tǒng)研究是可行的。本研究利用FIASCO磁珠富集法開發(fā)桑樹荷葉白品種的基因組DNA的SSR位點引物，并對這些引物是否能夠擴增及其多態(tài)性進行驗證，以期為桑樹遺傳圖譜的構(gòu)建、比較基因組結(jié)構(gòu)和功能分析等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的8份桑樹種及變種材料均采自安康學(xué)院蠶?；厣浞N質(zhì)資源圃。具體品種（系）的來源情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 桑樹基因組DNA提取 采摘各供試桑種質(zhì)材料的新鮮嫩芽（約0.1 g），用改良CTAB法提取桑樹基因組的總DNA。

1.2.2 桑樹SSR引物開發(fā)

1）限制性酶切及連接。以桑樹中的典型代表品種荷葉白作為引物開發(fā)試驗材料，基因組用MseⅠ進行單酶切。酶切體系40 μL：模板DNA 1 μg，10×T4 DNA ligase Buffer 4 μL，MseⅠ（10 U/μL）1 μL、T4 ligase DNA 酶1 μL，其余用ddH2O補齊。25 ℃作用2 h。

2）預(yù)擴增。預(yù)擴增做4管，每管的擴增體系和反應(yīng)程序如下：PCR擴增體系為20 μL，含連接接頭的酶切DNA 1 μL、2×PCR mix 10 μL、M00 20 pmol、Taq酶1 U，其余用ddH2O補齊。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

3）PCR產(chǎn)物純化。將獲得的200 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒進行產(chǎn)物純化。

4）磁珠富集含有SSR位點的片段。用FIASCO磁珠富集法于磁場中收集上清液，將收集到的DNA濃縮后用E00、M00再次進行PCR擴增。

5）陽性克隆的篩選。用pMD18-T載體的通用引物M13-47（CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC）或RV-M（GAGCGGATAACAATTTCACACAGG）與重復(fù)序列（AG）9/（GT）9組成的雙引物對AG/GT富集文庫菌落進行篩選檢測。反應(yīng)體系如下：DNA模板，單菌落（體積為0）；2×PCR Mix 7.5 μL，M13-47/RV-M（20 μmol/μL） 0.15 μL，20 μmol/μL （AG）9/（GT）9 0.15 μL，Taq酶 0.2 μL，ddH2O 7 μL，總體積15 μL。

反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 33次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對擴增出清晰電泳條帶的菌落進行質(zhì)粒測序。

6）引物設(shè)計。利用Chromas軟件查看序列峰圖，手工校正序列，并篩選出含有SSR位點的序列。利用DNAman軟件去除載體和接頭序列，CodonCode Aligner軟件進行序列比對分析，去除重復(fù)序列后用Primer5軟件進行SSR引物設(shè)計，并送華大基因生物公司合成。

1.2.3 SSR引物擴增分析 PCR的反應(yīng)體系20 μL，包括模板DNA 25 ng，10×Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，10 μmol/L F-primer 0.25 μL，10 μmol/L R-primer 0.25 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，其余用ddH2O補齊。

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，變性 30 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 5 min， 32個循環(huán)。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對引物擴增進行檢測，選擇擴增產(chǎn)物為目的條帶且擴增穩(wěn)定的進行5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

選取PAGE電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，以“1”和“0”分別記錄條帶的“有”和“無”。在相同片段位置上有帶記為“1”，無帶記為“0”。一個引物為一個等位基因位點，將每個樣品在各個等位基因位點的片段大小，即其表現(xiàn)型按照Convert 1.31軟件要求的格式錄入到Excel中，然后用Convert 1.31軟件轉(zhuǎn)化成POPGENE軟件所要求格式。用POPGENE32軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)擴增產(chǎn)物電泳檢測

為了獲得富集文庫，對酶切產(chǎn)物進行預(yù)擴增試驗，結(jié)果如圖1。結(jié)果表明，預(yù)擴增試驗獲得500 bp左右的擴增產(chǎn)物，引物符合試驗要求。

2.2 克隆PCR檢測

利用RV-M和（GT）9組成的雙引物從構(gòu)建的2個富集文庫進行克隆PCR檢測（圖2）。結(jié)果顯示，陽性克隆擴增條帶清晰且單一，陽性菌占到檢測菌落數(shù)的37.5%。

2.3 SSR位點PCR擴增引物的設(shè)計及引物評價

在發(fā)現(xiàn)SSR位點的基礎(chǔ)上，依據(jù)其兩端的保守序列，設(shè)計了46對SSR位點PCR擴增引物（表2）。為了檢測所設(shè)計的46對引物組合在桑屬內(nèi)PCR擴增的有效性，以表1所列的雞桑、垂桑、荷葉白、新一之瀨、劍持、倫教40、葫蘆桑、巖桑8個桑樹品種為材料進行PCR擴增，并進行等位位點多樣性檢測，結(jié)果見表3。從表3可以看出，引物SP4、SP12、SP14、SP16、SP17、SP45、SP46在8個樣品中均沒有擴增到目的片段，引物SP2、SP8和SP28在個別樣本中沒有擴增到目的片段，引物SP6雖然在瓊脂糖中擴增得到目的片段，但擴增條帶顯影太弱，且不穩(wěn)定，不適合進行PAGE檢測。其他35對引物在8個檢測樣本中均獲得了穩(wěn)定的目的條帶。

從46對引物中篩選出38對有目的條帶且擴增穩(wěn)定的引物用于多態(tài)性驗證。8份材料的SSR-PCR擴增結(jié)果見表4。結(jié)果表明，38對SSR引物共擴增出清晰譜帶210條，不同引物的擴增帶數(shù)1～12 條不等，平均每對引物的擴增條帶數(shù)為5.526 3條，帶數(shù)最多的為SP11（12條），最少的為SP1和SP24（各1條）；每對引物組合可檢測到SSR多樣性位點數(shù)為3～9個，共檢測到106個多樣性位點。根據(jù)軟件POPGENE計算得出觀察雜合度值Ho，其中Ho值范圍從0（說明無多態(tài)性）到1（說明無限多個等位形式具有相同的頻率）；所有位點的平均PIC值為0.645 8，最高位0.890 0，最低為0，即除了引物對SP1和SP24之外，其他均為多態(tài)性位點。

2.4 SSR位點在桑屬系統(tǒng)分類中的應(yīng)用

SSR電泳結(jié)果顯示，8份供試材料在SSR水平上表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性差異。按照SSR擴增條帶的表型進行聚類分析，結(jié)果表明這8份桑材料聚為2簇。從圖3和表5可以看出，野生品種葫蘆桑和巖桑聚為Ⅰ組，兩者遺傳距離較近，為0.746 0，遺傳相似系數(shù)為0.474 3。栽培品種垂桑、荷葉白、劍持、新一之瀨、倫教40聚為一枝后，與雞桑聚為同一簇（Ⅱ組），其中劍持與荷葉白遺傳距離最近（0.169 5），遺傳相似系數(shù)最大（0.844 1）。雞桑在Ⅱ組中與荷葉白的遺傳距離最遠（0.959 2），遺傳相似系數(shù)最?。?.383 2）。即在供試材料中，劍持和荷葉白的親緣關(guān)系最近，葫蘆桑和巖桑與荷葉白的親緣關(guān)系最遠。

3 小結(jié)

桑樹SSR引物開發(fā)及分析成功的關(guān)鍵是獲取高質(zhì)量的基因組DNA。采用改良CTAB法提取桑樹DNA，通過0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明DNA無降解，帶型整齊。選出38對有穩(wěn)定目的擴增條帶的引物用于8份桑樹材料的多態(tài)性驗證，結(jié)果表明，38對SSR引物共擴增出清晰譜帶210條。不同引物的擴增帶數(shù)1～12條，平均每個引物的擴增帶數(shù)為5.526 3條。帶數(shù)最多的是SP11，為12條；最少的是SP1、SP24，各1條。每對引物組合可檢測到SSR多樣性位點數(shù)為3～9個，共檢測到106個多樣性位點。所有位點的平均PIC值為0.645 8，最高位0.890 0，最低為0。即除了引物對SP1和SP24之外，其他均為多態(tài)性位點。

8份供試材料在SSR水平上表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性差異。野生品種葫蘆桑和巖桑聚為Ⅰ組，遺傳距離較近，為0.746 0，遺傳相似系數(shù)為0.474 3；栽培品種垂桑、荷葉白、劍持、新一之瀨、倫教40聚在一起后與雞桑聚為Ⅱ組，其中劍持與荷葉白遺傳距離最近（0.169 5），遺傳相似系數(shù)最大（0.844 1），雞桑在Ⅱ組中與荷葉白的遺傳距離最遠（0.959 2），遺傳相似系數(shù)最?。?.383 2）。即在供試的材料中，劍持和荷葉白的親緣關(guān)系最近，葫蘆桑和巖桑與荷葉白的親緣關(guān)系最遠。該研究開發(fā)的桑樹SSR引物將為桑樹遺傳多樣性分析與親緣關(guān)系、種質(zhì)資源利用、育種群體的建立等奠定基礎(chǔ)。

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