基于SRAP和IRAP標記的野生君遷子居群取樣策略分析

摘要：君遷子（Diospyros lotus L.）是中國栽培柿（D. kaki Thunb.）的主要砧木，其適應性和繁殖能力強，表型變異豐富，存在多個變種和近緣種，在國內廣泛分布。目前，有關君遷子居群的取樣策略尚不完全清楚。試驗以1個野生君遷子自然居群（40個單株）和8個外類群種質為試材，利用SRAP和IRAP標記技術分析其居群取樣策略。結果表明，20對SRAP引物擴增出188條譜帶，多態性比例為94.68%；9條IRAP引物共擴增出102條譜帶，多態性比率為95.10%。UPGMA聚類分析表明，君遷子居群分別與柿和浙江柿（D. glaucifolia L.）獨立成組。供試君遷子居群遺傳多樣性信息參數隨取樣梯度的增加（5～35個單株）而增加。Nei’s基因多樣性指數（H）在取樣梯度為20個單株時達到總體的95%以上，Shannon信息指數（I）和多態性位點百分率（PPL）在取樣梯度為25個單株時分別達到總體的95%以上，隨著取樣梯度的進一步增加，Nei’s基因多樣性指數、Shannon信息指數和多態性位點百分率數值趨穩。綜上所述，基于遺傳多樣性信息參數（H、I、PPL）的居群取樣單株數量建議為20～25個單株。

關鍵詞：君遷子（Diospyros lotus L.）；分子標記；居群取樣策略；砧木

中圖分類號：S665.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2838-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.031

君遷子（Diospyros lotus L.；2n=2x=30）是柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros L.）植物中除栽培柿（D. kaki Thunb.）外的重要果樹，別名黑棗、軟棗、高加索柿等，是柿重要的砧木資源[1，2]。君遷子適應性和繁殖能力強，分布范圍廣，表型變異豐富[3]，存在多個變種和近緣種[4]，與富有（D. kaki cv. Fuyuu）系甜柿品種嫁接的親和性表現復雜[5，6]。有效保護和利用柿習用砧木君遷子及其所蘊藏的豐富遺傳資源對柿產業的可持續發展具有重要意義。野生種質資源的調查和采集受到人力和物力的限制，通常不能對某個居群的所有個體或某個物種的所有居群都進行采集或保護，只能采集或保護其中的一部分，然而人們又希望獲得盡可能多的遺傳變異以代表居群或物種的整體遺傳多樣性水平。因此，開展對野生種質資源遺傳多樣性調查、保護和利用的研究，首先考慮的問題便是最佳的居群取樣策略。遺傳多樣性的取樣策略是指對一定地理分布范圍內的生物個體取樣時，使樣本具有代表性和包含盡可能多的遺傳變異信息的最佳取樣方法[7]；它在很大程度上受到生物自身特性、生長環境和取樣目的的影響。試驗以一個野生君遷子居群的40份單株和華中農業大學柿圃活體保存的7份柿品種及1份浙江柿（D. glaucifolia L.）種質為試材，基于SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism）和IRAP（Inter-retrotransposon Amplified Polymorphism）標記技術分析君遷子居群的最佳取樣策略，以期為國內野生君遷子種質野外科學采集、生物多樣性保護的研究提供工作基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料共48份，其中40份單株采自位于大別山東部的安徽省六安市金寨縣天堂寨鎮馬石村（北緯31.1885°-31.1889°；東經115.7691°-115.7695°；海拔為600～710 m）的一個君遷子自然居群；采用簡單隨機取樣方式進行居群內單株取樣。富有、松本早生（Matsumoto-wase fuyuu）、上西早生（Uenishi-wase）、次郎（Jirou）、前川次郎（Maekawa-jirou）、陽豐（Youhou）和羅田甜柿（Luotian Tianshi）7份栽培柿（2n=6x=90）品種及1份浙江柿（2n=2x=30）種質均采自華中農業大學柿圃（北緯30.4772°，東經14.3603°，海拔為30 m）。

1.2 DNA提取

利用CTAB法[8]提取幼嫩葉片基因組DNA；采用Nano Drop 2000超微量分光光度計和瓊脂糖電泳檢測DNA質量。

1.3 SRAP標記擴增

SRAP擴增參考Guo等[9]研究結果，采用20 μL PCR反應體系，含1×Buffer，2.5 mmol/L Mg2+，正向和反向引物各300 nmol/L，200 μmol/L dNTPs，50 ng模板DNA，1 U Taq酶。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃、1 min，35 ℃、1 min，72 ℃、1 min，5個循環；94 ℃、1 min， 50 ℃、1 min，72 ℃、2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。共篩選到20對多態性較好的引物組合，序列信息見表1；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 IRAP標記擴增

IRAP擴增參考Du等[10]的方法，采用20 μL PCR反應體系，反應體系含1×Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，正向和反向引物各400 nmol/L，250 μmol/L dNTPs，50 ng模板DNA，1 U Taq酶。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃、1 min，50 ℃、1 min， 72 ℃、1 min，35個循環；72 ℃ 延伸6 min。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用9條引物及序列信息見文獻[10]，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5 數據統計與分析

試驗得到的圖譜清晰、重復性強的電泳條帶用0/1矩陣統計；采用NTSYS-pc version 2.10[11]統計分析軟件計算材料間的Dice相似指數，并利用UPGMA法（Unweighted Pair Group Method Arithmetic Averages）進行聚類分析；運用Microsoft Office Excel 2010軟件處理試驗所得數據并作圖，從君遷子居群總體（40個單株）中模擬抽取5、10、15、20、25、30、35等7個不同取樣梯度的樣本，各取樣梯度重復抽取10次；采用POPGENE1.32[12]分析軟件計算不同抽樣梯度下的觀測等位基因數（Number of allele， Na）、有效等位基因數（Effective number of allele，Ne）、Nei’s基因多樣性指數（Nei’s gene diversity index，H）、Shannon信息指數（Shannon’s information index，I）和多態性位點百分率（Polymorphic loci，PPL）等遺傳多樣性信息。

2 結果與分析

2.1 SRAP和IRAP標記的多態性分析

分別從已發表的SRAP和IRAP引物序列信息中篩選出已得到較好擴增結果的20對和9條引物，其擴增譜帶大小均在200～2 000 bp。將SRAP和IRAP標記的多態性信息含量進行比較，結果見表2。從表2可見，SRAP和IRAP分別擴增出188條和102條譜帶，其中多態性譜帶分別為178條和97條，多態性比例分別為94.68%和95.10%。IRAP的平均擴增譜帶數（11.33）和平均多態性譜帶數（10.78）略高于SRAP（分別是9.40、8.90）；但是，有效多重系數、多態性信息含量和標記指數則是SRAP（分別是3.71、0.31、1.15）高于IRAP（分別是2.02、0.27、0.55）；同時，SRAP和IRAP結合的標記指數（1.72）均高于SRAP和IRAP各自獨立的標記指數。

2.2 SRAP和IRAP標記的聚類分析

基于SRAP和IRAP分析數據，計算出48份柿屬種質的Dice相似系數，結合2種分子標記獲得的UPGMA聚類結果見圖1。從圖1可見，40份野生君遷子居群單株間遺傳變異豐富并單獨聚類成組，與7份柿品種和1份浙江柿種質獨立分開，說明SRAP和IRAP數據結合分析具有較高的可靠性，因此可用于進一步的君遷子居群取樣策略分析。

2.3 SRAP和IRAP標記的居群取樣策略分析

基于SRAP和IRAP標記、利用POPGENE1.32軟件分析野生君遷子居群的遺傳變異情況，結果見表3。從表3可見，基于SRAP和IRAP標記均能檢測到較高的居群遺傳多樣性，但SRAP的多態性位點百分率（88.51%）、觀測等位基因數（1.89±0.33）、有效等位基因數（1.57±0.36）、Nei’s基因多樣性指數（0.32±0.18）和Shannon信息指數（0.47±0.24）均高于IRAP（分別是85.26%、1.85±0.36、1.49±0.33、0.29±0.17、0.44±0.23），而采用SRAP和IRAP數據結合分析的居群遺傳多樣性介于SRAP和IRAP上述參數之間（分別是87.36%、1.87±0.33、1.54±0.35、0.31±0.18、0.46±0.24）。

對不同單株取樣量前提下大別山野生君遷子居群的SRAP和IRAP遺傳多樣性信息參數分7個取樣梯度進行統計，結果見表4。從表4可見，當取樣量為5株時，君遷子居群的遺傳多樣性信息參數最低；當取樣量為35株時，君遷子居群的遺傳多樣性信息參數最高；隨著單株取樣量的增加，君遷子居群的各項遺傳多樣性信息參數均呈逐漸增大的趨勢。

采用Nei’s基因多樣性指數（H）、Shannon信息指數（I）和多態性位點百分率（PPL）3項遺傳多樣性信息指標分析君遷子居群的取樣策略，結果見圖2。從圖2可見，H、I和PPL均隨著取樣梯度的增加（從5株到35株）而增加；當取樣量為20株時，H達到總體（40株）的96.23%（超過95%），I和PPL達到總體的92.05%和94.08%；當取樣量為25株時，I和PPL分別達到總體的96.75%和95.32%（均超過95%）；當遺傳多樣性信息參數超過總體95%后，H、I和PPL這3項遺傳多樣性信息參數的數值趨穩。3項遺傳多樣性信息參數均隨著取樣量的增加而增加，但不同遺傳多樣性信息參數隨樣本量增加而增幅不同，這說明隨機選取20～25個單株就能代表和反映一個居群的整體遺傳特性（達到樣本總體遺傳多樣性信息參數的95%以上）。

3 討論

君遷子是中國柿栽培主要的砧木，全國有17個省（市、自治區）具有分布，絕大部分種質資源處于野生或半野生狀態，主要生于海拔500～2 300 m左右的山地、山坡、山谷灌叢中，在北方地區僅有少量栽培[1，2，4]。在柿的分類上，完全甜柿（Pollination Constant Non-astringent，PCNA）在樹上就能自然脫澀、去皮即可脆食，其無需人工脫澀和良好口感等商品價值相對于非完全甜柿（Non-PCNA）更具備市場競爭優勢[13]，已在云南、福建、山西、湖北等省初具產業規模。現在生產上綜合性狀表現良好的完全甜柿品種如富有、太秋（Taishu）等與習用砧木君遷子嫁接表現出早期不親和或后期不親和，尤其是結果太多時樹勢易速衰[5，14]，且新育成的早秋（Soshu）、甘秋（Kanshu）等品種或多或少具有富有系遺傳背景。而國內君遷子分布范圍廣、變異類型豐富，推測與富有系嫁接廣親和的君遷子砧必然存在；基于形態、生理、解剖和分子水平的研究，國家柿種質資源圃（陜西楊凌）尚存20年生的君遷子與富有嫁接親和性及生長勢同本砧差異不顯著（西北農林科技大學，數據未發表）的事例。因此，開展君遷子收集、保存和評價工作，篩選出與主栽甜柿品種嫁接親和度高、適應性強且早實豐產的配套優良砧木將對國內甜柿產業可持續發展具有重要意義。

金燕等[15]對野生大豆居群的研究表明，隨機取樣量應保持在35～45株時方能代表居群整體并反映居群的整體遺傳特性。劉文獻等[16]對華山新麥草2個居群的6、10、14、18、22、26、30等7個單株取樣梯度進行研究表明，當樣本量為18時，包含了居群95%以上的變異。課題組利用SRAP和IRAP分子標記對生長于大別山東部的一個野生君遷子居群分單株進行取樣策略研究，結果表明在各取樣梯度上的觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei’s基因多樣性指數（H）、Shannon信息指數（I）和多態性位點百分率（PPL）均存在隨樣本量的增加而隨之變大的趨勢。為了更準確地說明居群取樣量與遺傳多樣性信息參數之間的關系，采用H、I和PPL這3種遺傳多樣性信息參數作為評判標準，當君遷子居群取樣量為20株時，基于H的遺傳多樣性信息參數就包含了居群總體95%以上的遺傳變異；而當取樣量為25株時，基于I和PPL的遺傳多樣性信息參數方能達到居群總體95%以上的遺傳變異；隨著取樣量的進一步增加各項遺傳多樣性信息參數（H、I和PPL）的變化基本趨于一致。說明對君遷子居群進行野外考察收集、保護及多樣性研究過程中，按照野生取樣原則，選取20～25個單株就能代表和反映一個君遷子居群的整體遺傳特性。

綜上所述，供試君遷子遺傳多樣性豐富，基于遺傳多樣性信息參數（H、I、PPL）的居群單株取樣數建議設為20～25株。基于以上君遷子取樣策略的研究，結合柿屬植物已經開發的分子標記[9，10]和居群遺傳分析水平，有望在挖掘君遷子新類型以及合理利用與保護野生君遷子種質方面獲得更多的理論依據。

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