清香型小曲白酒機械化釀造過程中細菌多樣性及釀造性能分析

摘要：研究清香型小曲白酒機械化酒釀造過程中的細菌多樣性，分析不同種屬的細菌釀造性能。優選酒醅中微生物基因組的提取方法，優化PCR擴增V3區核酸序列的程序和DGGE凝膠的電泳條件。PCR擴增V3區核酸序列的最佳退火溫度為54 ℃，120 V電泳8 h的DGGE凝膠有22條差異明顯的條帶，切膠PCR擴增，測序比對鑒定出22種細菌。種屬優勢菌芽孢桿菌和乳酸桿菌為主要風味功能菌。雞葡萄球菌、人葡萄糖球菌、肺炎克雷伯菌、肉芽腫桿菌、食酸叢毛單胞菌為傾向有害菌。高溫糖化時期細菌的主要種類為耐熱的芽孢桿屬，肺炎克雷伯菌和肉芽腫桿菌在發酵階段侵入到酒醅中。

關鍵詞：清香型；小曲白酒；DGGE；細菌多樣性；釀造性能

中圖分類號：Q93-3；TS261.1；TS262.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2860-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.037

清香型小曲白酒釀造過程中的微生物有細菌、酵母菌和霉菌。不同種類的細菌對白酒品質的影響不同，有的細菌產生的淀粉酶、酯化酶等對出酒率和酒的香味有重要影響[1]，有的細菌代謝產生酸類、醛類等物質，這些物質對香型的呈現和品格的提升具有重要意義。對新生產環境中細菌多樣性的系統研究是揭示白酒機械化釀造機理，指導實際生產，提升品質、提高出酒率以及更好地發揮機械化效能必需的研究內容。

近年來，隨著生物化學技術和分子生物學技術的發展，細菌多樣性的研究方法也在不斷發展，目前已有較多細菌多樣性研究方法，如傳統的純培養方法、Biolog法[2]、磷脂脂肪酸法[3]、分子生物學方法。隨著重組DNA技術的出現和發展，分子生物學方法被廣泛用于細菌多樣性分析。現代分子生物學技術能夠揭示DNA序列遺傳多態性，可以用于推斷系統發育關系，通過數據庫比較來鑒定未知細菌[4]，克服了傳統培養技術的限制，對樣品的分析比較全面、客觀，進而更精確地反映樣品信息。變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）被廣泛用于微生物多樣性的研究，如分析自然環境中細菌、藍細菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性，具有加樣量小、不需要培養、突變檢出率高、非同位素性、操作簡便快速等優點。目前，對細菌的研究主要為酒曲和窖泥中細菌多樣性的分析，對整個釀造過程中細菌多樣性的研究鮮見報道。本試驗采用DGGE法對清香型小曲白酒機械化釀造整個過程中細菌的多樣性進行研究，為機械化釀造清香型小曲白酒設備的改進和工藝的優化提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

清香型小曲白酒機械化生產過程中糖化和發酵酒醅，糖化取樣為8、24 h的酒醅，發酵取樣為0～15 d的酒醅，每天取1次樣。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 SDS-酚-氯仿抽提法，參照孟鎮等[1]的方法；試劑盒提取方法，采用天根生化科技（北京）有限公司生產的土壤基因組提取試劑盒提取總DNA，步驟參考說明書。

1.2.2 基因擴增條件優化 采用適用于大多數細菌及土壤細菌的16S rDNA V3區的通用引物：引物341F（5′-TACGGGAGGCAGCAG-3′）、引物518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）、引物GC-341F（5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCC CCCGCCCGCCTACGGGAGCAGCAG-3′）。

PCR反應體系：5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ plus），4 μL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），0.25 μL Taq酶 （5 U/μL），1 μL模板DNA，1 μL上游引物（20 μmol/L）， 1 μL下游引物（20 μmol/L），37.75 μL去離子水。

PCR擴增反應程序：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，退火溫度分別選取50、52、53、54 ℃， 退火45 s，72 ℃延伸1 min（30 個循環）；延伸72 ℃ 7 min，4 ℃保存。取8 μL PCR產物與2 μL SYBR GREENⅠ染液混合，點樣到0.7%的瓊脂糖凝膠上，于1×TAE緩沖液中75 V電泳40 min，電泳結束后，放入凝膠成像系統（Bio-Rad）顯影。

1.2.3 DGGE電泳條件優化 DGGE電泳采用DCodeTM System Mutation Detection System（BIO-RAD）系統。電泳條件：先用注射針取20 μL按1∶1混合的PCR回收產物和2×Loading dye點樣進行恒壓電泳20 min，30%～70%的變性梯度，1×TAE電泳緩沖液，選取合適電壓和時間60 ℃恒溫電泳進行條件優化。凝膠顯色采用銀染法。產物送至北京六合華大基因科技有限公司測序，將序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中進行Blast分析，根據最相似的種屬確定微生物的種類。

1.2.4 細菌釀造功能分析 對于檢測出的細菌進行分析，初步了解其功能特性，對細菌釀造功能進行分析。

2 結果與分析

2.1 基因組提取

SDS-酚-氯仿抽提法適用于細菌基因組的提取，從試驗結果來看，該方法并不適用于酒醅中微生物基因組的提取，原因是酒醅中含有大量的淀粉、果膠質等高分子量物質，SDS-酚-氯仿抽提法不能有效地促進DNA與大分子量物質的分離，因此提取效果較差。從圖1可知，SDS-酚-氯仿抽提法僅在發酵的8、10 d提取出微生物的基因組。由于發酵8、10 d淀粉等大分子被降解，所以SDS-酚-氯仿抽提法能提取出微生物基因組。提取的基因組中可能含有酵母菌和霉菌的基因組，但是由于引物的特異性，可以特異擴增出細菌的V3區核酸序列，而擴增不出酵母菌和霉菌的核酸序列。

由于土壤基因組提取試劑盒能有效地促進微生物基因組DNA與大分子量物質的分離，能有效沉淀基因組DNA，所以提取效果較好。采用土壤基因組提取試劑盒提取的基因組DNA長度都大于20 kb，由于擴增的模板僅有230 bp左右，所以能滿足擴增的要求，并且該提取方法提取的基因組沒有彌散帶，電泳條帶僅有一條，說明提取時較好地保存了片段的完整性，其他樣品基因組的提取都采用土壤基因組提取試劑盒的方法提取。

2.2 引物擴增V3區的退火溫度優化

從圖2可以看出，在設定的退火溫度52、53、54 ℃都能擴增出目的條帶，退火溫度為54 ℃時，擴增出的條帶最亮，這說明擴增的條帶DNA濃度大，符合DGGE上樣要求。當退火溫度為54 ℃時，條帶大小在230 bp附近，這與目的條帶大小較為接近，而且DNA含量較高，因此該溫度為最優退火溫度。

以提取的所有樣品的基因組DNA為模板，采用帶GC的引物擴增產物，瓊脂糖電泳結果如圖3所示。所有樣品擴增的PCR產物條帶單一，亮度較亮，能滿足DGGE電泳的要求。

2.3 DGGE 電泳條件優化

DGGE凝膠電泳條件受多種因素的影響，經過多次條件優化得到結果較好的兩個電泳條件：140 V電泳7 h和120 V電泳8 h，電泳結果如圖4所示。從圖4可知，電泳條件為140 V、電泳7 h得到的條帶寬度大，不能把電泳遷移距離小的條帶相互分離開，不能達到充分分離不同序列的目的。

120 V電泳8 h得到的條帶可以充分分離條帶，而且電泳條帶較多，這說明該條件可以用于樣品條帶中序列多樣性的分析，因此選擇120 V、電泳8 h的條件作為電泳的最佳條件。

2.4 DGGE條帶切割位點優化

用最佳條件120 V電泳8 h，電泳條帶顯色后切割。條帶與膠孔底部的距離相同，表明是序列相同的條帶，條帶與膠孔底部的距離不同，則表明是不同的條帶。選取不同的條帶，切割清晰、亮度大、附近雜帶少的條帶。經過分析，有22個不同的序列，切割序列的位置如圖5所示。從條帶分布來看，5、6、22號條帶對應的序列在發酵的不同階段含量有變化，表明這3個序列對應的細菌在釀造期間數量變化大，而且僅在釀造的某個階段存在。10號條帶在整個釀造過程中都有，而且在發酵后期對應的序列濃度增大，這表明該條帶對應的細菌數量在逐漸增加。

2.5 菌種比對結果

如表1所示，序列測序后對比鑒定得到22種細菌，其中可培養的有20種，不可培養的有2種。PCR-DGGE分析顯示，食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans）、龍舌蘭芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、海洋細菌（Uncultured Oceanobacillus sp.）、枝芽孢桿菌（Virgibacillus）、腸桿菌科細菌（Enterobacteriaceae bacterium）、面包乳桿菌（Lactobacillus panis）、泛酸枝芽孢桿菌（Virgibacillus pantothenitus）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）及擬桿菌（Uncultured bacteroidetes）在整個釀造過程中都存在。

2.6 細菌釀造性能分析

經比較分析，清香型小曲白酒中具有釀造功能的細菌有：雞葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌、肉芽腫桿菌、分散泛菌[5]、腸桿菌科細菌、云南微球菌[6]、發光桿菌、人葡萄糖球菌、食竇魏斯氏菌[7]。這些細菌在釀造過程中對提升酒的產量或質量沒有作用，其自身的生長代謝消耗一定的營養物質，其中雞葡萄球菌的代謝產物對酒品質沒有影響，但菌株本身在特定條件下具有一定致病性[8]；肺炎克雷伯菌和肉芽腫桿菌的代謝產物對酒品質沒有影響，但菌株本身產生非揮發性的毒素，在特定條件下具有一定致病性[9，10]；人葡萄糖球菌的代謝產物對酒品質沒有影響，但菌株本身在特定條件下具有一定致病性[11]。

阿耶波多芽孢桿菌在發酵過程中分解纖維素，產酸、生香味物質，產生香味物質的前體物質，產生淀粉酶等，對提升酒的產量或風味具有一定作用[12]；食果糖乳桿菌發酵產生乳酸；短纖丁酸梭菌產生丁酸，對風味物質的形成具有一定作用；解淀粉芽孢桿菌具有葡萄糖苷酶、淀粉酶活性，能夠強烈抑制引起食品腐敗的真菌，產生風味前體類物質；龍舌蘭芽孢桿菌在發酵過程中產酸、香味物質、香味物質的前體物質、淀粉酶等，菌株對提升酒的產量或風味具有一定作用[13]；枝芽孢桿菌在發酵過程中產生香味物質、香味物質的前體物質；面包乳桿菌發酵產乳酸；凝結芽孢桿菌能產生乳酸，對風味物質的形成具有一定作用；食酸叢毛單胞菌不能發酵多數糖類，對真菌有一定的抑制作用；泛酸枝芽孢桿菌產生泛酸。

解淀粉芽孢桿菌、食酸叢毛單胞菌還具有抑制腐敗霉菌的作用，這些菌的存在可以減少腐敗霉菌侵入到釀造體系帶來的副作用。在細菌體系中，大部分是有益菌，對釀造有害的細菌沒有檢測到，這可能是觀音土曲不含耐熱的有害菌，或者是觀音土曲中的有害菌在糖化階段由于高溫環境大都被殺滅，而且釀造的低溫和相對較高的酒精度可抑制有害細菌的滋生。芽孢桿菌屬和乳酸菌屬是細菌的優勢種屬。芽孢桿菌屬和乳酸菌屬細菌的釀造功能主要是產生香味成分或香味成分的前體物質，是清香型小曲白酒風味形成的主要功能菌。

在發酵14 d和發酵7 d侵入到釀造體系的兩種傾向有害菌肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和肉芽腫桿菌（Klebsiella granulomatis）產生非揮發性的毒素，非揮發性的毒素在蒸餾階段滯留在酒醅中。蒸餾工藝具有把毒素與酒體分離的功能，從而確保酒的品質安全。

3 小結與討論

研究結果表明，土壤試劑盒法提取酒醅中微生物基因組DNA效果較SDS氯仿抽提法好；PCR退火溫度選擇54 ℃，得到的條帶較亮；DGGE選擇電壓120 V電泳8 h能獲得最好的結果。在采用DGGE分析酒曲細菌區系組成時，在糖化和發酵階段都檢測到不可培養的細菌，與Zoetendal等[14]研究結果相似。本研究結果也驗證了DGGE鑒定微生物的優勢，可對不能培養或未培養的微生物進行鑒定分析。

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