QuEChERS結合HPLC—MS/MS法測定鮮煙葉中的2種抑芽劑

摘要：建立鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈2種抑芽劑的高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）檢測方法。以乙腈為提取溶劑，對鮮煙葉中2種抑芽劑進行提取，采用新型復合吸附劑的QuEChERS凈化方法，用N-丙基乙二胺（PSA）、C18和石墨化碳黑（GCB）3種復合吸附劑凈化，HPLC-MS/MS測定，以電噴霧正離子模式（ESI+），iFunnel離子聚焦，多反應監測（MRM）模式下進行檢測，基質匹配外標法定量。通過優化條件，在10～500 μg/kg范圍內，二甲戊樂靈、仲丁靈的檢測線性相關系數（R2）均大于0.995，檢出限（LOD）為1.5～2.4 μg/kg，定量限（LOQ）為5.0～7.9 μg/kg，在3個添加水平下的回收率范圍88.1%～96.4%，相對標準偏差（RSD）為3.2%～9.3%。試驗方法可用于鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈抑芽劑的準確測定。

關鍵詞： QuEChERS；復合吸附劑；抑芽劑；鮮煙葉；高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）

中圖分類號：O657.7；TS41+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2888-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.045

煙草抑芽劑主要包括馬來酰肼、二甲戊樂靈、仲丁靈和氟節胺4種，可以提高煙葉產量和品質，其中二甲戊樂靈、仲丁靈（圖1）在煙葉中的殘留量較低，成為了目前成熟、研究多、應用廣泛的2種煙草抑芽劑[1，2]，但有研究表明這2種抑芽劑可以毒害細胞并損害DNA，引發直腸癌和肺癌[3-5]。2014年，食品安全國家標準規定二甲戊樂靈和仲丁靈這2種抑芽劑的每日允許攝入量（ADI）分別為0.03和0.2 mg/kg[6]。抑芽劑關系到煙草質量安全，生產者需要對抑芽劑使用以及在鮮煙葉中的殘留進行監測，以防止抑芽劑的濫用[7，8]。因此，建立快速、準確、靈敏的鮮煙葉中抑芽劑的檢測方法迫在眉睫。

已有關于不同基質中抑芽劑類物質分析方法的研究報道，常見的前處理方法有液液萃取（LLE）[9]、固相萃?。⊿PE）[10]、凝膠滲透色譜法（GPC）[11，12]和QuEChERS[13，14]，這幾種方法都存在一些不足之處，如LLE有機溶劑消耗量大，SPE操作復雜，GPC方法重現性不好。經典的QuEChERS方法雖簡便快速，但采用單一吸附劑難以去除鮮煙葉中對質譜檢測干擾較大的葉綠素、糖類、脂肪酸等雜質，也無法適用于鮮煙葉中抑芽劑的殘留分析。關于鮮煙葉中抑芽劑的檢測方法，國內鮮有相關文獻報道，本研究采用新型復合吸附劑的QuEChERs凈化方法，有效地去除鮮煙葉中雜質的干擾，結合HPLC-MS/MS技術，能夠快速、簡便、準確地測定鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈2種抑芽劑的殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6490三重四極桿質譜儀（美國Agilent公司）；渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；離心機（美國Beckman Coulter公司）；超純水系統（美國Millipore Milli-Q Gradient公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；氮吹儀（美國Caliper LifeSciences公司）；SR-2DS型水平振蕩器（日本TATEC公司）。

試劑：甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；石墨化碳（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）、C18（天津Agela Technologies公司）；二甲戊樂靈、仲丁靈（德國Dr. Ehrenstorfer公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma公司）；無水MgSO4、NaCl（分析純，上海國藥集團）。

標準溶液：準確稱取二甲戊樂靈和仲丁靈標準品（精確至0.000 1 g），用甲醇分別溶解并配制成100.0 mg/L的標準儲備液；混合2種標準溶液，臨用前取標準儲備液用甲醇稀釋成10 mg/L的標準溶液，儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取 取適量鮮煙葉，去除主脈，剪碎后放入均漿機中充分絞碎。準確稱取絞碎的樣品2.0 g，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，在水平振蕩器上振蕩提取10 min，然后加入1.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl，立即渦旋1 min，防止無水MgSO4結塊，最后以5 000 r/min離心8 min。

1.2.2 凈化 吸取2.0 mL離心后的上清液，將上清液轉移至裝有30 mg C18、50 mg PSA和10 mg GCB吸附劑的5.0 mL離心管中，渦旋2 min，5 000 r/min離心3 min。吸取1.0 mL的上清液，用氮氣吹至近干，殘留物用甲醇∶水（9∶1，V/V）定容至1.0 mL后過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.3 測試條件

高效液相色譜條件Agilent Eclipse XDB-C18 column（150 mm×4.6 mm，5 μm），在線過濾器（Agilent 公司）；流動相A為甲醇，B為0.1%（V/V）甲酸水溶液；等度洗脫甲醇∶0.1%甲酸水（90∶10，V/V）；流速0.4 mL/min；運行時間13.0 min；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；毛細管電壓3 500 V；霧化氣壓力1.4×10-5 Pa（20 psi）；干燥氣溫度250 ℃；干燥氣流量15 L/min；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流量11 L/min；采集方式多反應監測模式（MRM），其他參數見表1。

2 結果與分析

2.1 QuEChERS方法的條件優化

2.1.1 提取溶劑 二甲戊樂靈、仲丁靈具有疏水性，難溶于水，易溶于有機溶劑乙腈、甲醇、乙酸乙酯等。使用甲醇、乙酸乙酯提取時，萃取雜質較多，且吸附劑凈化效果不理想；乙腈對2種分析物的提取效率較高，吸附劑凈化效果理想，并且對鮮煙葉中的色素、蠟質、脂肪等非極性成分提取的較少，通過鹽析更容易去除乙腈中的水分，所以本試驗選用乙腈作為提取溶劑[15]。

2.1.2 吸附劑的種類和用量 鮮煙葉中的葉綠素含量高，用PSA和C18凈化時，葉綠素雜質幾乎無法去除，有研究表明GCB是凈化葉綠素的理想吸附劑，但對二甲戊樂靈和仲丁靈這種含有芳香環及對稱性結構的物質有較強的吸附作用[16]。試驗考察了GCB的用量對目標物質回收率的影響，隨著GCB用量從5 mg增大到30 mg，提取溶劑雖更加澄清無色，但2種抑芽劑的回收率顯著降低（圖2）。當GCB用量為10 mg時，2種抑芽劑的回收率均在95%以上，滿足檢測要求。故選取10 mg GCB作為凈化葉綠素的吸附劑。

PSA去除脂肪酸、有機酸和多糖的效果較好，但去除色素、甾醇的能力一般；C18可以去除部分色素、甾醇和脂肪，但對非極性物質有較強的吸附[15]；煙葉中含有葉綠素、脂肪和多糖等雜質較多，為了在靈敏度、回收率和凈化效果之間找到最佳的平衡點，試驗對C18-PSA-GCB復合吸附劑的用量比對凈化效果的影響進行了考察，結果（圖3）發現，采用以質量比3∶5∶1的C18-PSA-GCB 3種吸附劑，可獲得最佳的凈化效果，2種抑芽劑的平均回收率達到93%以上。因此，選擇C18-PSA-GCB（3∶5∶1，質量比）為凈化吸附劑。

綜合以上因素，鮮煙葉用乙腈提取后，采用C18-PSA-GCB（3∶5∶1，質量比）吸附劑凈化，不但回收率滿足要求，而且減少了鮮煙葉中復雜基質對質譜離子源的污染。

2.1.3 色譜條件的優化 分別選用超純水、乙腈和甲醇作為流動相進行考察，發現甲醇-水溶液作為流動相時，色譜峰和分離度達到最佳效果，進一步對比了甲醇-水溶液和甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液體系為流動相，結果（圖4）發現，以甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液為流動相時的峰面積增加40%以上，這是因為在正離子模式下加酸有助于目標物質離子化。同時對Waters ACQUITY UPLC C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB-C18 column（150 mm×4.6 mm，5 μm）2種色譜柱的分離效果進行了比較，發現XDB-C18對2種化合物的分離較好。

2.1.4 質譜條件的優化 目標物質屬于苯胺類化合物，易于質子化，采用ESI+模式進行掃描。分別配制100 μg/L的2種單標準工作液，采用直接進樣的方式注入離子源中，在m/z為100～1 000掃描范圍內以正離子模式進行一級質譜掃描，發現目標化合物的[M+H]+峰較強；然后以此[M+H]+為母離子，進行子離子掃描，找到各物質的2個特征碎片離子（圖5）。

2.1.5 線性關系、檢出限和定量限 在優化的試驗條件下進行了方法學的考察。配制二甲戊樂靈和仲丁靈2種抑芽劑的基質匹配標準溶液，分別為5、10、50、100、200、500 μg/kg，以提取離子色譜圖的峰面積（y）為縱坐標，標準液濃度（x）為橫坐標建立線性回歸方程，在陰性樣品中添加目標化合物，按照給定的方法測定，以3倍信噪比（S/N）對應的添加水平作為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對應的添加作為定量限（LOQ），計算結果見表2?？梢娫摲椒ㄇ袑嵖尚小?/p>

2.1.6 回收率和精密度 用空白基質加標法進行回收率和精密度試驗，選取陰性鮮煙葉為空白樣品，分別添加相當于20、50和100 μg/kg水平的二甲戊樂靈和仲丁靈混合標準溶液，每個含量水平做6個平行樣品，連續測定3 d，結果見表3?？梢娫摲椒蚀_度和精確度均較好。

3 結論

本研究優化了儀器參數和樣品前處理條件，采用改進的QuEChERS-高效液相色譜串聯質譜法，建立了鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈2種抑芽劑的分析方法。該方法簡單、快速、靈敏度高、準確度好、溶劑消耗量少，能有效去除葉綠素等雜質干擾問題，實現了復雜基質中目標化合物準確的定性和定量分析需求，可廣泛用于鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈2種抑芽劑的測定。該研究為抑芽劑的合理施用、大田的實時監控、鮮煙葉原料的殘留控制提供了技術方法，對采取措施降低抑芽劑的危害具有現實意義。

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