香蕉α—1 4—葡聚糖淀粉磷酸化酶基因家族全基因組鑒定與進化分析

摘要：為了研究香蕉（Musa nana Lour.）α-1，4-葡聚糖淀粉磷酸化酶（α-1，4-glucan starch phosphorylase，PHS）基因家族的特征和功能，利用生物信息學方法對香蕉PHS家族進行了全基因組查找、鑒定及相關分析。結果表明，在香蕉中共鑒定出2個成員，MaPHS1的開放閱讀框長度為2 784 bp，編碼927個氨基酸，分子質量為104.8 ku，等電點為6.59；MaPHS2的開放閱讀框長度為2 517 bp，編碼838個氨基酸，分子質量為95.09 ku，等電點為6.09。MaPHS1和MaPHS2分別含有17個和15個外顯子；MaPHS1和MaPHS2均含有淀粉磷酸化酶的保守性基序，進化過程中比較保守。

關鍵詞：香蕉（Musa nana Lour.）；α-1，4-葡聚糖淀粉磷酸化酶；生物信息；基因家族；進化分析

中圖分類號：S668.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）12-3200-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.051

Abstract： In order to uncover the characteristics and functions of PHS（α-1，4-glucan starch phosphorylase） gene family in banana，the PHS family in banana were searched，identified and analyzed in whole genome level through using the bioinformatics methods. The results showed that two members in banana were identified. The open reading frames of MaPHS1 and MaPHS2 were 2 784 and 2 517 bp in length，coded 927 and 838 amino acids with protein molecular weights were 104.8 and 95.09 ku， pI were 6.59 and 6.09. Intron/exon structure analysis indicated that MaPHS1 contained 17 extons and 16 introns， whereas MaPHS1 contained 15 extons and 14 intron. MaPHS1 and MaPHS2 were contained starch phosphorylase conserved motif，MaPHS were an evolutionarily conserved gene family.

Key words： banana（Musa nana Lour.）； α-1，4-glucan starch phosphorylase； bioinformatics； gene family； phylogeny analyses

淀粉磷酸化酶在高等植物碳水化合物代謝，即淀粉的合成和降解過程中發揮動態調節的作用[1]。淀粉磷酸化酶和糖原磷酸化酶類似，惟一的差異就是淀粉磷酸化酶作用的底物是淀粉而非糖原。植物的α-葡聚糖磷酸化酶通常也被稱為淀粉磷酸化酶（EC 2.4.1.1），通過磷酸化作用分解淀粉。淀粉磷酸化酶由2個亞基組成，并且每個亞基都含有高度保守的C-端催化區域（1個磷酸吡哆醛位點和1個影響非催化葡聚糖結合的“儲存”位點）[2]。淀粉磷酸化酶催化可逆反應是淀粉磷酸化酶催化α-1，4-葡聚糖和無機磷酸鹽轉化為葡萄糖-1-磷酸[3，4]。淀粉磷酸化酶廣泛存在高等植物中[5-7]。馬鈴薯[8]、甘薯[9]、木薯[10]、擬南芥[11]、玉米[12]等多種植物中已有報道。調查發現，淀粉磷酸化酶在高等植物中有2種同工酶型，為質體形式與胞質形式[13]。質體形式主要位于葉綠體或造粉體中，分子質量大于100 ku；胞質形式，分子質量約為90 ku[14]。2種不同形式的淀粉磷酸化酶對葡聚糖的親和性方面存在差異，低親和型為質體形式，又稱為Pho-L型；高親和型為外質體形式，又稱為Pho-H[15]。2種不同形式的淀粉磷酸化酶的結構不同，且反應所需的底物也存在差異。質體形式淀粉磷酸化酶Pho-L對支鏈淀粉具有高度的親和性，而胞質形式的淀粉磷酸化酶Pho-H對支鏈淀粉的親和性很小[16]。

香蕉是熱帶、亞熱帶最為重要水果之一，淀粉的合成與降解是香蕉果實發育過程中重要的生理過程，不僅決定著香蕉的產量，同時也決定著香蕉果實的品質。香蕉果實中糖積累方式是典型的淀粉轉化型，光合產物輸入果實后，首先轉化為淀粉形式積累于果實中直至成熟，采后后熟過程中淀粉分解轉化為可溶性糖。香蕉果實在發育過程中碳水化合物主要以淀粉形式存在，未成熟果實中淀粉含量可達到20%～25%，后熟過程中淀粉逐漸降解，轉化為可溶性糖。香蕉果實采后后熟過程中，淀粉含量變化很大，從原來的20%下降到軟化時的1%，與此同時可溶性糖含量增加，完全水解后，可溶性糖含量突增至15%～20%[17]。

有關淀粉磷酸化酶的研究對了解果實成熟機理及果實品質的形成具有重要的意義。然而當前在基因組水平對香蕉PHS基因家族鮮有報到。本研究通過對香蕉最新測序的全基因組數據庫搜索，利用生物信息學的方法，對香蕉PHS基因家族進行了鑒定與比較分析，通過對PHS基因家族成員的基本信息分析，為后續鑒定香蕉PHS蛋白的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 香蕉PHS基因數據來源

香蕉PHS基因、蛋白和CDS數據來源于Banana Genome Hub數據庫（http：//banana-genome.cirad.fr/）的香蕉種小果野蕉全基因組數據和Phytozome 10.3（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）；擬南芥PHS蛋白序列來源于Tair（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）；水稻、玉米、高粱PHS數據來源于Phytozome 10.3（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

1.2 香蕉PHS蛋白生物信息學分析

香蕉PHS蛋白氨基酸序列基本理化性質采用在線軟件ProtParam（http：//expasy.org./tools/protparam.html）分析。二級結構采用在線SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopmahtml）分析，所有參數均為默認值。利用在線工具GreenPhyl V4分析不同物種中PHS蛋白中的數量（http：//www.greenphyl.org/cgi-bin/family.cgi？p=idfamily_id=1325#tab-famcomp）。通過NCBI CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測PHS蛋白的保守結構域。

1.3 香蕉PHS基因結構分析

將從香蕉全基因組數據庫得到的香蕉PHS基因序列和cDNA序列， 利用Gene Structure Display Server （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析基因結構。

1.4 香蕉PHS進化樹構建

將香蕉PHS蛋白和擬南芥、水稻、玉米、高粱蛋白通過Clustalx 1.83軟件進行多重序列比對后采用MEGA6.0軟件構建系統進化樹。參數設置：使用neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構建，選擇了成對刪除（paiwise deletion）空位（gap）的選項， Bootstrap method取值1 000。

1.5 香蕉PHS蛋白的結構和保守基序查找與注釋

蛋白的保守基序采用MEME4.0 （http：//meme.nbcr.net/meme/）分析， 基序的最大數目設置為10， 基序長度設為6～200個氨基酸。對得到的保守基序運用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線工具進行功能注釋。

2 結果與分析

2.1 香蕉PHS蛋白家族成員的鑒定

根據香蕉全基因組數據庫以及擬南芥、水稻、玉米等其他植物中淀粉磷酸化酶基因序列信息，從香蕉全基因組中鑒定到2個 PHS 淀粉磷酸化酶家族成員（表 1），其登錄號分別為GSMUA_Achr4G32600_

001和GSMUA_Achr6G33840_001。通過PFAM及 NCBI-CDD工具進行蛋白質結構分析，2個香蕉PHS蛋白均含有α-葡聚糖磷酸化酶特征結構域（圖1）。其中，GSMUA_Achr4G32600_001與擬南芥AtPHS1（AT3G29320）同源，命名為MaPHS1；GSMUA_ Achr6G33840_001與擬南芥AtPHS2（AT3G46970）同源，命名為MaPHS2。MaPHS1定位于4號染色體，基因方向為反向；該基因全長7 906 bp，開放讀碼框長度2 784 bp，編碼927個氨基酸；分子質量為104.8 ku。MaPHS2定位于6號染色體，基因方向為正向；該基因全長7 888 bp，開放讀碼框長度2 517 bp，編碼838個氨基酸；分子質量為95.09 ku。MaPHS1和MaPHS2的等電點分別為6.59和6.09，偏酸性。不穩定指數分析發現2個MaPHS蛋白不穩定指數均大于40，為不穩定蛋白。疏水性分析表明，2個MaPHS蛋白均為親水性蛋白。利用在線工具GreenPhyl V4分析發現在37個物種中PHS蛋白的數量為265個（圖2）。由保守區預測（圖1）顯示，MaPHS具有保守的糖基磷酸化催化區，由功能區預測顯示，MaPHS1和MaPHS2蛋白分別在765～777及675～689處有1個磷酸吡哆醛結合位點：EASGTSNMKFA（S）M（L）N。

分析MaPHS蛋白二級結構（表2）表明，二級結構均由α-螺旋、擴展鏈結構、β-轉角和無規則卷曲4種形式組成，其百分比大小為α-螺旋>無規則卷曲>擴展鏈結構>β-轉角。利用Plant-mPLoc對MaPHS基因家族的蛋白質進行亞細胞定位分析發現均定位于葉綠體中。

2.2 香蕉PHS家族基因結構及系統進化分析

利用GSDS軟件構建MaPHS基因結構（圖3），MaPHS1由17個外顯子和16個內含子組成；MaPHS2由15個外顯子和14個內含子組成。為研究MaP5CS基因系統進化關系，利用雙子葉植物擬南芥和單子葉水稻、玉米、高粱的P5CS蛋白序列為參考，利用MEGA軟件對香蕉基因組中的PHS蛋白采用鄰接法繪制系統進化樹，結果如圖4所示。

2.3 PHS蛋白的結構和保守基序分析

通過MEME軟件預測PHS蛋白結構結果如圖5所示。利用SMART軟件對預測的保守基序進行命名結果見表3所示。結果表明，香蕉PHS蛋白均含有8個基序（基序1～7，9），不包含基序8和10。AtPHS1含有9個基序，相比PHS2多了基序8，長度為80個氨基酸。進一步通過SMART在線工具對基序命名，基序1～7為磷酸化酶保守結構域。

3 小結與討論

淀粉磷酸化酶在淀粉代謝發揮重要的作用，其有2種不同的類型，即PHS1和PHS2[13]，根據對糖原親和程度不同分為低親和型與高親和型，PHS1為低親和型，PHS2為高親和型[15]。PHS在模式植物擬南芥和禾本科植物中高度保守，大多為2個PHS蛋白。袁亞芳[4]對水稻額淀粉磷酸化酶進行了較為深入的研究，分析了2個不同類型PHS基因的表達特性，并通過基因工程手段將該基因導入植株體內，從而改良稻米品質。劉世才[18]在鹽藻中克隆了PHS1，并進行了系統的生物信息學分析。

淀粉是香蕉果實中的主要成分，在香蕉采后果實品質形成過程中，淀粉大量水解轉化為可溶性糖，在達到最佳食用期時果實淀粉含量只有1%。正是由于香蕉果實采后成熟過程中淀粉的降解轉化使得果實具有獨特的口感、適宜的硬度及豐富的營養[19]。而淀粉磷酸化酶在淀粉降解過程中發揮著重要的作用[20]，研究淀粉磷酸化酶的功能對了解果實發育成熟機理和果實品質形成具有重要的意義。

本研究對香蕉PHS基因家族進行了初步分析， 為深入研究該基因家族的表達調控、結構和功能等提供參考數據，通過調控其表達來達到提高香蕉果實成熟中淀粉降解轉化為可溶性糖的能力，進一步提高香蕉果實的品質。

參考文獻：

[1] SCHNEIDER E M，BECKER J，VOLKMANN D. Biochemical properties of potato phosphorylase change with its intracellular localization as revealed by immunological methods[J].Planta，1981，151（2）：124-134.

[2] DAS A，PRADHAN S，SHARMA S G. Starch phosphorylase enzyme is over-expressed in submerged rice（Oryza sativa L） plant[J].Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2006， 15（1）：51-53.

[3] NAKAMURA Y，ONO M，UTSUMI C，et al. Functional interaction between plastidial starch phosphorylase and starch branching enzymes from rice during the synthesis of branched maltodextrins[J].Plant and Cell Physiology，2012，53（5）：869-878.

[4] 袁亞芳.水稻淀粉磷酸化酶基因的表達及對稻米品質影響的研究[D].江蘇揚州：揚州大學，2007.

[5] FUKUI T，SHIMOMURA S，NAKANO K.Potato and rabbit muscle phosphorylases： Comparative studies on the structure，function and regulation of regulatory and nonregulatory enzymes[J].Molecular and Cellular Biochemistry，1982，42（3）：129-144.

[6] STEUP M. Starch degradation[J]. The Biochemistry of Plants， 1988，14：255-296.

[7] KUMAR A. Starch phosphorylase in plants[J]. Journal of Scientific Industrial Research，1989，48（12）：568-576.

[8] BRISSON N，GIROUX H，ZOLLINGER M，et al. Maturation and subcellular compartmentation of potato starch phosphorylase[J].The Plant Cell，1989，1（5）：559-566.

[9] LIN C，YEH K，LEE P，et al.Primary structure of sweet potato starch phosphorylase deduced from its cDNA sequence[J]. Plant Physiology，1991，95（4）：1250-1253.

[10] KUMAR A，SANWAL G G. Starch phosphorylase from tapioca （Manihot utilissima） tuber： Isolation and some physico-chemical properties[J]. Indian J Biochem Biophys，1984，21：241-247.

[11] CASPAR T，LIN T，KAKEFUDA G，et al. Mutants of Arabidopsis with altered regulation of starch degradation[J].Plant Physiology，1991，95（4）：1181-1188.

[12] SPILATRO S R，PREISS J. Regulation of starch synthesis in the bundle sheath and mesophyll of Zea mays L. Intercellular compartmentalization of enzymes of starch metabolism and the properties of the ADPglucose pyrophosphorylases[J]. Plant Physiology，1987，83（3）：621-627.

[13] STEUP M，LATZKO E. Intracellular localization of phosphorylases in spinach and pea leaves[J].Planta，1979，145（1）：69-75.

[14] SHIMOMURA S， NAGAI M， FUKUI T. Comparative glucan specificities of two types of spinach leaf phosphorylase[J]. Journal of Biochemistry，1982，91（2）：703-717.

[15] NAKANO K，MORI H，FUKUI T. Molecular cloning of cDNA encoding potato amyloplast A-glucan phosphorylase and the structure of its transit peptide[J]. Journal of Biochemistry，1989，106（4）：691-695.

[16] KLECZKOWSKI L A. Glucose activation and metabolism through UDP-glucose pyrophosphorylase in plants[J].Phytochemistry，1994，37（6）：1507-1515.

[17] 金志強.香蕉果實生長發育的生理學與分子生物學[M].北京：中國農業大學出版社，2006.

[18] 劉世才.鹽藻淀粉磷酸化酶基因DsSP的克隆和原核表達[D].遼寧大連：大連海洋大學，2014.

[19] 遲光紅，徐碧玉，賈彩紅，等.香蕉果實采后淀粉磷酸化酶活性、基因克隆及表達研究[A].中國生物學會生命科學與生物技術前沿學術會議論文集[C].浙江寧波：中國生物工程學會，2008.

[20] 王 園，王甲水，謝學立，等.香蕉泛素結合酶基因與果實成熟關系的研究[J].園藝學報，2010，37（5）：705-712.