安康七里香薔薇rpl36—rps8基因序列分析

摘要：研究安康地區七里香薔薇（Rosa banksiae var.normalis）和薔薇科其他植物間的親緣關系，選擇安康地區七里香薔薇，對其葉綠體rpl36-rps8序列進行擴增、測序，與GenBank中其他薇科植物的rpl36-rps8序列同源性進行對比分析，利用系統發育分析軟件MEGA6，運用鄰接法（Neighbor Joining）建構了系統發育樹。結果表明，七里香薔薇與薔薇屬的大花香水月季同源性很高。

關鍵詞：七里香薔薇（Rosa banksiae var.normalis）；rpl36-rps8；序列分析

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）12-3204-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.052

Abstract：To study relationships of indicate between Rosa banksiopsis and other plants of rosaceae.In this experiment Rosa banksiopsis from ankang was used as experimental material. By extracting genome DNA and PCR amplification，the rpl36-rps8 sequence can be acquired. Then，through Homologous Analysis and comparison of rpl36-rps8 sequences of the plant and other kinds of rosaceae plants in GenBank and with the help of phylogenetic tree by way of Neighbor Joining in MEGA6，the relationship can be compared and analyzed. The experiment showed that Rosa banksiopsis and Rosa odorata has high homology.

Key words：Rosa banksia var.normails；rpl36-rps8r；sequence analysis

七里香薔薇（Rosa banksiae var.normalis） ，又名單瓣白木香、七里香、木香花，是薔薇科薔薇屬木香植物的一個變種[1]。奇數羽狀復葉，小葉3～5，卵狀長橢圓形至披針形，長約2.5～5.0 cm，緣有細鋸齒。托葉線形，與葉柄離生或基部稍與葉柄合生，早落。傘房花序，花白色，單瓣，有芳香。七里香薔薇為木香花野生原始類型，枝條蔓生，是重要的攀緣觀賞花木，廣泛生長于中國秦嶺山區。植物的葉綠體基因組分為非編碼區與編碼區，由于非編碼區基因進化速率比編碼區基因較快，所以非編碼區基因多數用于低階元的系統發育分析。本試驗研究七里香薔薇葉綠體rpl36-rps8基因序列，通過與其他薔薇科植物的序列比對分析，并構建系統進化樹，從分子水平揭示七里香薔薇與薔薇科植物的親緣關系，為七里香薔薇種質鑒別提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 七里香薔薇采自安康市香溪洞景區外圍地區，采集其莖尖幼嫩葉片，取回實驗室保存于4 ℃備用。

1.1.2 試驗試劑 Biospin植物基因組DNA提取試劑盒購自北京佰億新創科技有限公司；清潔PCR產物的試劑盒購自Qmega 公司；質粒抽提試劑盒產自Sangon Biotech公司；Taq DNA 聚合酶、pGEM-T Easy載體均購寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增 PCR擴增反應以提取的3種植物DNA為模板， 擴增rpl36-infA-rpS8序列正向引物rpl36f：5′-CACAAATTTTACGAACGAAG-3′，反向rps8：5′-TAATGACAGAYCGAGARGCTCGAC-3′。PCR反應體積25 μL，包含MgCl2（25 mmol/L）2 μL， dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，上、下游引物各（2.5 μmol/L）1.0 μL，DNA聚合酶1.0 U，DNA模板1 μL（約30 ng）。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產物純化及克隆 將PCR產物瓊脂糖電泳片段用DNA回試劑盒回收，并pGEM-T載體連接。將重組質粒轉入大腸桿菌DH5α，接種到含青霉素的LB培養基平板并挑取單菌落，重組質粒經PCR鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 序列的分析處理 利用NCBI在線BLAST程序，在核酸數據庫（Nucleotide database）中進行同源性分析，運用MEGA6軟件分析構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 七里香薔薇基因組DNA的提取結果

提取后的總DNA通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過圖1可以看出，提取的DNA為一條清晰條帶，植物的總DNA完整性比較好，可以滿足后續的序列擴增要求。

2.2 rpl36-rps8序列PCR擴增結果

以七里香薔薇葉綠體基因組DNA為模板，用rpl36-rps8引物進行PCR擴增，擴增產物通過凝膠成像分析儀分析如圖2。結果表明，PCR產物約在500 bp處出現了清晰的單一擴增條帶，與預期大小基本相符。

2.3 重組質粒的提取及鑒定

每個序列分別選取生長良好的3個白色菌落，使用質粒小提試劑盒Ⅰ提取質粒，得到的質粒進行電泳，用空載體作為對照得到質粒電泳結果如圖3所示。將插入rpl36-rps8序列成功的質粒進行PCR擴增，得到質粒PCR電泳結果如圖4所示。

2.4 七里香薔薇與其他薔薇科植物rpl36-rps8 DNA的序列比較

以薔薇科（Rosaceae）為外類群，用Clustalx1.83進行比對，用MEGA6制作系統進化樹。圖5為rpl36-rps8引物擴增測序拼接的序列制作的進化樹。從進化樹可以看出，分為兩個支系，扯根菜為一個支系，單獨存在；大花香水月季、金露梅、稠李、七里香薔薇為一個支系，具有共同的祖先。

對七里香薔薇、大花香水月季、金露梅、稠李、扯根菜基于rpl36-rps8序列測量遺傳距離。比較發現遺傳距離最小的是七里香薔薇與大花香水月季，其遺傳距離是0.019；遺傳距離最大的是與扯根菜，其遺傳距離是1.113，說明七里香薔薇與大花香水月季的的同源性較高，與扯根菜的同源性較低。

3 小結

以七里香薔薇為試驗材料，通過引物序列進行PCR擴增得到七里香薔薇的rpl36-rps8基因序列，并對其進行分析。rpl36-rps8序列系統發育分析結果表明，七里香薔薇和薔薇屬的植物在同一個分支上，并且遺傳距離也較小，說明七里香薔薇與薔薇科薔薇屬的植物同源性較高。葉綠體具有獨立基因組，被認為是內共生起源的細胞器[2]。葉綠體具有完整的遺傳系統，其遺傳物質被稱作葉綠體基因組。在裸子植物中，葉綠體基因組一般是父系遺傳[3]，而大多數被子植物的葉綠體基因組為母系遺傳，大約有20%左右可能是雙親遺傳或父系遺傳[4，5]。葉綠體基因在植物分子系統進化中的應用相當廣泛。但因為母系遺傳和低變異速率以及近緣類群信息變異位點的缺乏，限制其在近緣類群特別是雜交起源植物類群間的系統發育上的應用。所以在利用葉綠體進行七里香薔薇系統學分類時具有一定的局限性和片面性，如果將葉綠體進化樹和核進化樹相結合，并且對多段基因進行研究，結合傳統的形態和生理特征分析，表明七里香薔薇與薔薇科植物的親緣關系。

參考文獻：

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志.第三十七卷[M].北京：科學出版社，1985.

[2] NEUHAUSHE，EMES M.Nonphotosynthetic metabolism in plastids[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2000，51：111-140.

[3] HENRY D，CHRISTINE C.Molecular Biology and Biotechnology of Plant Organelles[M].Berlin：Springer Netherlands，2004.

[4] HuYC，ZHANG Q，RAO G Y.Occurrence of plastids in the sperm cells of caprifoliaceae：Biparental plastid inheritance in angiosperms is unilaterally derived from maternal inheritance[J].Plant Cell Physiol，2008，49（6）：958-968.

[5] ZHANG Q，SODMERGEN.Why does biparental plastid inheritance revive in angiosperms[J].J Plant Res，2010，123（2）：201-206.