枸杞子中OTA污染檢測方法的建立

摘要：建立枸杞子OTA污染的檢測方法，分別用100 mL甲醇-0.1 mol/L正磷酸（10∶1）溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水（4∶1）溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液等4種溶液提取寧夏枸杞子中OTA；取20 mL提取液過固相萃取柱（SPE），再用0.1 mol/L磷酸、雙蒸水淋洗，乙酸乙酯洗脫后氮氣吹干，流動相溶解；高效液相色譜法測定，條件為C18反相柱分離，乙腈-水-乙酸（99∶99∶2）為流動相，熒光檢測器（激發波長330 nm，發射波長460 nm）檢測。結果表明，5% NaHCO3+1% PEG 8 000溶液為最佳提取液，SPE柱純化后，HPLC測定，平均回收率為88.6%～118.0%，變異系數為3.16%～7.54%，可以作為檢測寧夏枸杞子中OTA污染的方法。

關鍵詞：寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）；赭曲霉毒素A；固相萃取

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）14-3733-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.049

Abstract：The method of determination OTA in wolfberry with SPE-HPLC was established in this paper. The dried wolfberry was grinded and extracted Ochratoxin A with methyl alcohol-0.1 mol/L phosphoric acid（10∶1），5% NaHCO3-1% PEG 8 000，methyl alcohol-water （4∶1） and 2% NaHCO3-15% NaCl. After C18 solid phase extraction column （C18-SPE） has activated with 5 mL Methanol，5 mL double diluted water， 5 mL Sodium hydrogen carbonate（30 g/L），the above extract 20 mL was firstly brought into C18-SPE column. Then the C18-SPE column was washed with 2 mL phosphoric acid （0.1 mol/L） and 2 mL double diluted water respectively and was eluted with 5 mL ethyl acetate subsequently. The eluent was dried with N2 gas. The residue was dissolved with 0.2 mL of mobile phase for determination. The chromatographic column was C18 reversed-phase column（150 mm×4.6 mm i.d.） for separation. Mobile phase was acetonitrile-water-acetic acid（99∶99∶2）. A high performance liquid chromatography determined with fluorescence detection. The excitation wavelength is 330 nm. The emission wavelength is 460 nm.The recoveries of this method were between 88.6% and 118.0%，and coefficient of variation varied from 3.16% to 7.54%. This method can be used to detection OTA in wolfberry.

Key words：Ningxia wolfberry（Lycium barbarum L.）；Ochratoxin A；solid-phase extraction

赭曲霉毒素（Ochratoxin）是一類結構相似的生物毒素，有OTA、OTB、OTC、OTD 4種化合物，其中OTA毒性最強、分布最廣、污染最嚴重，國際癌癥研究機構IARC將其確定為2B類致癌物[1]。OTA的分子質量為403.8，熔點169 ℃，為無色晶體，易溶于極性有機溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水，在紫外光下OTA呈綠色熒光，最大吸收峰為333 nm[2]。OTA由許多霉菌產生，主要有炭黑曲霉（Aspergillum carbonarius）、黑曲霉（A.niger）、棘孢曲霉（A.aculeatus）、塔賓曲霉（A.tubingensis）和青霉（Penicillium spp.），這些微生物平時存在于種植園土壤及殘葉上，其中一種或幾種在果實期轉為果棲微生物并產生毒素，積累在干果中或隨果粒榨汁進入發酵過程。果酒、干果食品中OTA相當穩定，一般的烹調和加工方法只能部分破壞[3，4]。OTA的污染在全球范圍內都比較嚴重，不僅在糧谷類（主要是小麥、大麥、玉米和燕麥）、豆類、花生、動物飼料、葡萄、可可、咖啡豆等干果中發現OTA污染，而且在香料、茶葉、調味料、咖啡、巧克力、中草藥、罐頭食品、油、豆制品、啤酒、葡萄酒、葡萄汁等飲料中也已經檢測到了OTA，甚至在以糧食為飼料動物體內及其肉、奶和奶制品等動物性食品中也常有被OTA檢出，通過食物鏈蓄積對人類健康構成威脅[5，6]。

枸杞子是由寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）鮮果干燥制成的干果，由于其鮮果為漿果，含水率高，且表皮有蠟質層覆蓋。因此，制干時間需要較長，致使其易生霉變，采摘后的枸杞鮮果不經任何處理，1 d后就會有霉菌生長，2 d后霉變率為30%～40%，3 d后則高達50%～80%。采用太陽能干燥裝置干燥枸杞，其平均霉變率也在20%左右。在霉變過程中，炭黑曲霉、黑曲霉、塔賓曲霉和青霉這些產OTA的菌就有可能生長繁殖并產生OTA毒素[7，8]。目前，關于枸杞子中OTA污染的研究鮮見報道，有必要開展關于枸杞OTA污染狀況的研究。本研究以采用有機溶劑或碳酸氫鈉等溶液為提取液提取寧夏枸杞中的OTA，再用固相萃取柱（SPE）進一步凈化，最后以高效液相色譜（HPLC）檢測OTA，摸索一種簡便高效的測定寧夏枸杞中OTA含量的方法，為寧夏枸杞安全生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

枸杞子，購自寧夏銀川市同心路市場。

1.2 儀器

固相萃取裝置、C18-SPE柱（6 mL 500 mg）（美國Varian公司）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1200Series，美國Agilent公司）；熒光檢測器（Agilent Technologies 1200 Series）、C18反相柱（pH 2～12）（美國Agilent公司）；微量移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.3 試劑

OTA標準品（純度>99%，美國Fermentek公司）；乙腈和甲醇（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）；其他試劑均為化學純。

OTA標準儲備液的配制：1 mg OTA 標準品用色譜級甲醇完全溶解，定容至 50 mL（20 μg/mL，-20 ℃避光保存）。

OTA標準工作液的配制：取0.5 mL OTA 標準儲備液，用流動相定容至 100 mL（100 ng/mL，4 ℃避光保存）。

1.4 方法

1.4.1 樣品準備 稱取枸杞子5 g，加入OTA標準品溶液（1 μg/mL），放入平皿，置于真空冷凍干燥機中干燥12 h，粉碎機粉碎，使70%以上的樣品顆粒直徑在1 mm以下。

1.4.2 提取 粉碎枸杞子粉末中分別加入100 mL以下提取液：甲醇-0.1 mol/L正磷酸（10∶1）溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水（4∶1）溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液，磁力攪拌30 min， 15 000 r/min離心10 min，上清液用玻璃纖維濾紙過濾，取20 mL濾液上樣。

1.4.3 凈化方法 C18-SPE凈化方法，參考文獻[9-11]等方法。①C18-SPE萃取柱活化。C18-SPE柱依次用5 mL甲醇、5 mL超純水、5 mL 30 g/L碳酸氫鈉溶液沖洗小柱，保持柱子濕潤。②上樣。當碳酸氫鈉溶液下降到柱底時，立即將20 mL上樣液移入小柱。③淋洗。先用2 mL 0.1 mol/L磷酸淋洗，再用 2 mL超純水淋洗。④洗脫。用5 mL乙酸乙酯洗脫。用移液槍準確移取1 mL乙酸乙酯洗脫液到樣品瓶中，氮氣吹干。用0.2 mL色譜流動相溶解殘留物，經0.22 μm有機系濾膜過濾至樣液瓶內，供HPLC檢測。

1.4.4 HPLC檢測 色譜條件：參考AOAC2001方法[12，13]。色譜柱：C18反相柱（Eclipse XDB-C18分析柱，5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相∶乙腈；超純水∶冰乙酸=99∶99∶2，pH 3.2；流速：1.0 mL/min；熒光檢測條件：激發波長330 nm，發射波長460 nm；進樣量：20 μL。

1.4.5 指標計算 加標回收率=（加標樣品測定值-空白樣品測定值）/理論加標濃度×100%；

式中，X—樣品中OTA含量，ng/g；A—樣液 OTA峰面積；Am—標準液OTA峰面積；C—標準液OTA的濃度，ng/mL；V—處理后的最終樣液體積，mL；M—最終樣液相當的試樣質量，g。

2 結果與分析

2.1 線性范圍和檢測限

取OTA標準儲備液（20 μg/mL），用流動相為溶劑，分別配制濃度為2、3、5、10、20、60、80 ng/mL的OTA標準液，按高效液相色譜法條件進行檢測，每個標準濃度分別檢測5次。以OTA質量濃度y（ng/mL）對峰面積x進行回歸分析，線性方程為y=1.311 4x+0.286 3，相關系數R2=0.999 0。結果表明，OTA在2.0～80.0 ng/mL范圍內線性關系良好（圖1），OTA標品的保留時間為7.023 min（圖2）。

2.2 不同提取溶液提取測定結果比較

稱取寧夏枸杞子5 g，加入OTA標準工作液（1 μg/mL）10 μL，分別用4種提取液提取，SPE柱凈化，HPLC檢測，重復3次，結果見表1。5%NaHCO3-1% PEG 8 000溶液色譜圖見圖3。以5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液回收率最高，達88.7%，而以其他3種溶液為提取液的方法回收率在30%～67%，均未達到加標回收率達到85%～105%的要求。因此，采用5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液為提取液。

2.3 回收率及精密度試驗

制備加標濃度為2 ng/g的加標樣品，5% NaHCO3-1% PEG 8 000提取，SPE凈化，HPLC檢測，重復3次。結果表明，OTA的平均回收率為88.7%，標準差為3.58，變異系數為4.04%（表2），該方法的精密度、穩定性和重復性符合要求。

2.4 加標回收率試驗

分別制備加標濃度為0.5、1、2、3 ng/g的加標樣品，5% NaHCO3+1% PEG 8 000提取，SPE凈化，HPLC檢測，重復3次。結果表明，回收率為 88.6%～118.0%，變異系數為3.16%～7.54%（表3），說明該方法的回收率高，其準確度能滿足要求。

3 討論

提取是OTA檢測中重要步驟，可以依據其理化性質選用不同的提取劑，由于OTA易溶于極性有機試劑和稀碳酸氫鈉溶液性質，通常選用有機溶劑與酸性溶液（磷酸、乙酸或檸檬酸等）或碳酸氫鈉溶液的混合提取系統。本試驗選取甲醇-0.1 mol/L正磷酸（10∶1）溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水（4∶1）溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液4種提取液，其中以5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液回收率最高，達88.7%，而以其他3種溶液為提取液的方法回收率在30%～67%，均未達到加標回收率為85%～105%的要求。由于枸杞中含有大量色素和芳香物質，這些物質易溶于甲醇，可能出現乳化現象，致使甲醇-0.1 mol/L正磷酸（10∶1）溶液、甲醇-水（4∶1）溶液提取效率較低[14-17]。提取液中加入NaCl起到使溶液保持足夠電解質離子強度，增加提取效率[18-21]，但本試驗中采用2% NaHCO3-15% NaCl溶液作為提取液結果并不理想，可能由于枸杞含多糖量較高，與高離子濃度的NaCl作用，使提取液中出現呈現粉狀，不易過濾，導致OTA殘留在殘渣中，降低提取效率。而提取液5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液中加入分子質量8 000的聚乙二醇作為助濾劑使用，聚乙二醇較難溶解于水，不溶于甲醇，在進行均質并過濾時，可以有效地增加樣品顆粒的間隙，提高過濾效率[15，16]，獲得了88.7%的回收率，但回收率仍有優化的空間，在后續試驗中可采用磷酸/鹽酸化氯仿、氯仿、二氯甲烷，可能更進一步提高回收率[22]。

凈化也是OTA檢測中另一重要步驟，近年來免疫親和層析柱（Immuno-affinity chromatography， IAC）由于凈化效果好已被廣泛使用，SPE柱與免疫親和柱相比，使用的有機試劑較少，對環境和試驗人員的危害較小，價格相對便宜，被優先使用[21]。本試驗采用C18-SPE柱獲得了88.6%～118.0%回收率。但由于SPE柱對樣品中OTA的作用力為非特異性吸附力，加上枸杞子中含有豐富的枸杞多糖、單糖、色素等化合物，因此在保證較高回收率的同時凈化純度可能就不太理想，從加標樣的色譜圖中就可以反映出這一點，在精度要求更高試驗中可以采用 IAC柱來提高凈化程度[23]。

4 結論

5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液提取枸杞子中的OTA，再用固相萃取柱（SPE）進一步凈化，最后以高效液相色譜（HPLC）檢測，平均回收率為88.6%～118.0%，變異系數為3.16%～7.54%，是一種測定枸杞子中OTA污染較為可靠的方法。

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