結(jié)核桿菌的三種實驗方法的應用評估

摘要：目的 比較痰涂片法、熒光定量PCR法和結(jié)核抗體檢測法對結(jié)核病的診斷意義。方法 選取2014年7月～10月在我院診療疑似或確診患者172例，進行涂片抗酸染色、熒光（PCR）檢測和采集血樣進行結(jié)核抗體檢測。結(jié)果 172例檢樣中，抗酸染色痰液標本陽性例只有20例陽性率為11.6%。熒光PCR法陽性率55例，陽性率31.2%，結(jié)核抗體陽性例為87例；陽性率為50.6%。結(jié)論 三種方法中，以結(jié)核抗體陽性率最高，熒光PCR法次之，抗酸染色法陽性率最低，如果三種方法聯(lián)合運用，相互佐證，可提高準確性。

關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌；檢測方法

結(jié)核桿菌又稱分枝桿菌，是引發(fā)結(jié)核病的病原菌，可能對全身的各大器官造成侵害，臨床中以肺結(jié)核最為常見。結(jié)核桿菌細胞含有大量分枝菌酸，染色后能抵抗強脫色劑鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸桿菌，結(jié)核桿菌是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺結(jié)核為多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病，近年來，因艾滋病、吸毒等社會原因及免疫制劑的應用，其發(fā)病呈上升趨勢。鑒定結(jié)核桿菌的方法有很多[1]。本研究應用痰涂片染色法、PCR-熒光法、結(jié)核分枝桿菌抗體檢測，對172例標本同時進行比較和評價。

1資料與方法

1.1一般資料 收集自2014年7月～10月在我院診療疑似或確診的患者標本172例。所有患者均通過痰涂片抗酸結(jié)核桿菌檢驗、胸部X線片、臨床表現(xiàn)以及結(jié)核菌素試驗等診斷為肺結(jié)核。涂片法和熒光PCR為痰標本。囑患者留取晨痰2～5ml（結(jié)核患者需停抗結(jié)核藥3d）。結(jié)核抗體檢測則采靜脈血2ml。

1.2方法

1.2.1涂片染色鏡檢 是臨床常用的簡易快速的檢查方法：取痰或其他已外理好的標本0.1ml，于載玻片上均勻涂抹成2cm×2.5cm橢圓形范圍，以自然干燥和火焰固定后，進行抗酸染色，采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司的結(jié)核染色液。染色步驟：①石碳酸復紅溶液染色20min；②5%鹽酸酒精脫色3min；③亞甲基藍溶液染色30S。

1.2.2 PCR-熒光法采用實時熒光定量PCR法 試劑：試劑盒為中山大學達安基因公司產(chǎn)品。

方法：①取患者咳出的深部痰，痰液中加入4倍體積4 %NaOH液化痰液，30 min后吸1.5 ml置EP內(nèi)。②在金屬浴內(nèi)100℃（3～5 min）12000 r/min，棄上清液。③加入生理鹽水約1.5 ml混勻振蕩，離心棄上清液。④重復洗滌1次。⑤加入40 ml DNA提取液在金屬浴100℃ 10 min。⑥12000 r/min離心5 min標本處理完畢。⑦離心取上清2 ul至PCR反應管內(nèi)，反應管置定量PCR擴增儀內(nèi)，按以下條件進行擴增：93℃ -2 min預變性，93℃ 45 s-55℃ 60S 10個循環(huán)，93℃ 30 s-55℃ 45S 30個循環(huán)。擴增過程中儀器實時檢測熒光強度并分析增長曲線，根據(jù)Ct計算出樣本中DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）。陽性判斷標準為：增長曲線呈S型，最強熒光值增高20單位以上。

1.2.3結(jié)核分枝桿菌抗體檢測（膠體金法） 結(jié)核分桿菌抗體檢測：細菌在體內(nèi)生長繁殖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，包括IgA、IgE、IgM、IgG，檢測這些抗體可幫助診斷分枝桿菌感染。將結(jié)核分枝桿菌特異性膜蛋白抗原分離純化，點樣并固化在硝酸纖維膜上。膜上TB抗原捕獲人血清樣品中結(jié)核分枝桿菌抗體，被捕獲的結(jié)核IgG抗體可用葡萄球菌A蛋白（SPA）能與IgG特異性結(jié)合），形成紅色斑點，根據(jù)是否出現(xiàn)紅色斑點即可判斷陰、陽性結(jié)果從而判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌抗體。標本要求：必須使用新鮮的血清標本。血漿標本必須用玻璃剝離纖維蛋白，保證血清無混濁沉淀，以免吸入導致反應膜孔阻塞。試劑：上海奧普生物醫(yī)藥有限公司提供的標準操作說明進行。

1.3統(tǒng)計學分析 本研究中應用SPSS17.0的統(tǒng)計學軟件對得到的數(shù)據(jù)資料進行分析處理，陽性結(jié)果采用百分比（%）的形式表現(xiàn)，差異比較采用卡方值檢驗，以P<0.05作為三種檢測方法結(jié)果具有統(tǒng)計學意義的表現(xiàn)。

2結(jié)果

應用涂片染色鏡檢得到的陽性人數(shù)為20例，陽性率為11.6%；應用熒光PCR法得到的陽性人數(shù)為55例，陽性率為32.2%；應用膠體金法得到的陽性人數(shù)85例，陽性率達到50.6%。分析對比三組之間的結(jié)果差異較大，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3討論

對于肺結(jié)核的實驗室診斷，痰涂片法是檢測抗酸桿菌最普遍使用的方法，具有快速、簡便、經(jīng)濟、特異性高，但陽性率低（10%左右）等特點。建立快速準確的結(jié)核病原菌鑒定方法對于疾病的早期確診，發(fā)現(xiàn)、治療十分重要結(jié)核分枝桿菌核酸檢測（PCR-熒光法）可在1d內(nèi)完成臨床樣品處理、核酸提取和熒光PCR檢測全過程，具有反應快速、重復性好、靈敏度高等諸多優(yōu)點。本文檢測結(jié)果顯示，PCR法是隨著分子生物學發(fā)展而來的檢測方式，又稱之為聚合酶鏈反應技術(shù)，其中熒光PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高的特點。同時由于是全封閉環(huán)境下的反應，不需要進行后處理，很好的避免樣本受到污染，且由于操作便捷、規(guī)模化和自動化管理更加容易，具有非常廣闊的應用前景。傳統(tǒng)中認為TB很少存在于外周血液中，但是事實上淋巴組織與血管網(wǎng)都是細胞外液交換重要場所，而致病菌也會通過毛細血管壁進入到血液中，通過熒光PCR技術(shù)可以很好的檢出，本組中仍然對患者痰液標本進行檢測，與傳統(tǒng)的涂片法相比較，兩者有較好的一致性；在不選擇病例的前提下，前者的陽性率比后者高3倍左右。而且定量PCR是在全封閉狀態(tài)下實現(xiàn)PCR擴增和產(chǎn)物分析，完全杜絕了擴增產(chǎn)生污染而導致假陽性，結(jié)果真實可靠[2]我們認為對臨床疑似結(jié)核病患者，可根據(jù)病情選取不同的檢樣送檢、采用熒光定量PCR法檢測。其結(jié)果可作為結(jié)核病的主要診斷依據(jù)指標和篩選指標。這樣做的最大優(yōu)勢是可準確，快速的幫助臨床醫(yī)師確定診斷，提高診斷的準確率，縮短患者等確診的時間并及時得到治療[3]。

抗體檢測是一種快速、簡單、有較好的敏感性和特異性的結(jié)核病輔助手段，且陽性率較高，在未對樣本進行選擇的情況下，陽性率仍可達到50.6%。而且試劑和樣品用量極少，無需儀器設(shè)備，簡化了繁瑣的常規(guī)操作過程，同時也減小了因操作引起的誤差。該法簡便、快速、適應單人份測定，尤其適于基層醫(yī)院。但是靈敏度稍低，有一定的假陽性和假陰性：特異性稍差：結(jié)果判斷帶有主觀性；缺乏有效的質(zhì)控手段。其靈敏度和敏感性均有待提高[4，5]。

總之，三種方法聯(lián)合運用，可彌補單獨采用一種方法陽性率低的缺點，幾種方法之間可相互佐證，從而使準確性得以提高。同時檢測也可從不同方面滿足臨床需要，提高肺結(jié)核的診斷水平。

參考文獻：

[1]周珍文.分枝桿菌的實驗室診斷[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2014，3：37.

[2]李素華，王歡，陳莉.熒光定量PCR檢測TB-DNA在各類檢樣中的陽性率分析[J].西南國防醫(yī)藥，2007，17（6）：752～7533.

[3]鄒自英，朱冰.結(jié)核桿菌的細菌學、分子生物學和免疫生物學檢測方法評價[J].四川醫(yī)學，2011，5，32（5）.

[4]張靈霞，莊玉輝，楊華衛(wèi).DNA探針雜交檢測患者痰標本中結(jié)核桿菌研究[J].中國防癆雜志，2000，22（3）：127-129.

[5]徐苗，羅永艾，黎友倫，等.重組結(jié)核分枝桿菌11000蛋白對結(jié)核分枝桿菌感染的鑒別作用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（11）：762-765.編輯/孫杰