高效液相色譜法檢測乳制品的酪蛋白磷酸肽

梁艷，石丹，王艷萍

(1.內蒙古乳業技術研究院有限責任公司，呼和浩特 010110；2.內蒙古伊利集團液態奶事業部研發部，呼和浩特010110)

高效液相色譜法檢測乳制品的酪蛋白磷酸肽

梁艷1，石丹1，王艷萍2

(1.內蒙古乳業技術研究院有限責任公司，呼和浩特 010110；2.內蒙古伊利集團液態奶事業部研發部，呼和浩特010110)

采用高效液相色譜法對乳制品中的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide,CPP）質量分數進行檢測。樣品通過提取、凈化和上機測定，可以完全定性和定量分析CPP。結果表明，采用該方法可以使乳制品中的CPP得到很好的分離，且方法簡單、安全，結果準確可靠，檢驗數據重現性好。

高效液相色譜；乳制品；酪蛋白磷酸肽

0 引言

酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛奶酪蛋白為原料經蛋白酶水解、分離純化而得到的生理活性肽[1]，具有結合鈣和促進鈣吸收的功能[2-3]。

目前國內外對原料中CPP質量分數的檢測方法一般采用BaCl2—乙醇法，且乳制品中CPP的質量分數完全靠誠信添加。國內報道的乳制品中CPP的檢測方法主要有毛細管區帶電泳法[4-5]、液—質聯用法[6]和高效液相色譜法[7]。但毛細管區帶電泳法的干擾因素多、液—質聯用法的檢測成本高、高效液相色譜法沒有CPP標準品[9]。

目前檢測成品中的CPP質量分數時，要先用BaCl2—乙醇法檢測原料CPP的質量分數，再以原料的添加量來推算成品中的CPP質量分數，操作步驟繁瑣，耗時較長，不適于現代化生產的要求。鑒于此，本研究開發了一種操作簡單，省時，結果準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料與設備

酪蛋白磷酸肽。

BaCl2(分析純)，無水乙醇（色譜純），鹽酸（分析純），硫酸（分析純），三氯乙酸（色譜純），甲醇（色譜純），乙酸（色譜純），乙腈（色譜純）。

高效液相色譜儀。

1.2方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18 250×4.6 mm，5 μm；

柱溫為25℃；

流動相A為質量濃度為10 g/L的乙腈甲醇溶液，流動相B為質量濃度10 g/L的乙酸水溶液；

梯度洗脫的條件為：0～25 min流動相A由0%→100%；

流速為1.00 mL/min；

進樣量為20 μL，紫外檢測器波長為280 nm。

1.2.2 CPP原料的純化

（1）將CPP原料溶解后，調整pH值為4.6，定容為0.2 g/mL的CPP原料溶液，靜置30 min；

（2）將上述溶液在4℃、5 000 r/min離心15 min，取上清液，加入BaCl2使其濃度為0.05 mol/L，混勻后，得到一含有BaCl2的CPP原料溶液；

（3）以上述含有BaCl2的CPP原料溶液：無水乙醇=1∶2的體積比，在上述含有BaCl2的CPP原料溶液中加入無水乙醇，混勻后，在4℃靜置12～16 h；

（4）將上述靜置后的溶液在4℃、5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，以上述含有BaCl2的CPP原料溶液∶H2SO4=1∶0.4的體積比，在沉淀中濃度為0.125 M的H2SO4，用濾紙過濾；

（5）取上清液在60～70℃烘干60 min，之后在105℃烘干至恒重，得到純化的CPP原料。

1.2.3 標準曲線的繪制

將上述純化的CPP原料用超純水制備質量濃度為0.1，0.5，1，5，10，20 mg（每100 mL中）的系列標準工作液，采用高效液相色譜儀對該系列標準工作液進行檢測分析，繪制標準曲線。

1.2.4 樣品前處理

(1)提取。當樣品為液態乳制品時：稱取20 g樣品，用質量濃度為10 g/L的三氯乙酸（質量濃度10 g/L的三氯乙酸水溶液）定容至50 mL，超聲10 min，靜置過濾得待凈化液。

當樣品為固態乳制品時：稱取5 g樣品，用質量濃度為10 g/L的三氯乙酸溶解后定容至50 mL，超聲10 min，靜置過濾得待凈化液。

（2）凈化。將固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，取適當體積的待凈化液轉移至固相萃取柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，棄去淋洗液后用6 mL氨化甲醇洗脫至10 mL具塞試管中，整個固相萃取過程流速不超過1 mL/min，將洗脫液于50℃下用氮氣吹干，得到殘留物；將吹干后得到的殘留物用適當體積流動相A定容，過微孔濾膜后，將得到的上清液采用高效液相色譜儀進行檢測。

1.3樣品中CPP質量分數的計算

樣品中CPP質量分數（mg/100g）=[CPP上機質量濃度（mg/100 mL）×50 mL]/樣品質量（g）。

2 結果與分析

2.1樣品純化方法的確定

采用不同的樣品純化方法進行了實驗，結果如圖1所示。由圖1可以看出，在沒有經過固相萃取純化的樣品的高效液相色譜圖（a）上在標志峰附近也有峰出現，而經過固相萃取純化的樣品的高效液相色譜圖（b）上則少了很多干擾峰，尤其在標志峰不明顯的情況下，干擾峰對測試結果存在極為嚴重的影響，因此，采用固相萃取對待測樣品進行純化可以有效減少樣品中的其他物質對檢測造成的干擾，進而提高檢測的準確度。

圖1 不同前處理得到的樣品的色譜

2.2方法的精密度

本研究共進行了10次精密度實驗。分別在液奶和奶粉中添加了質量分數為0.50 mg/100 g和120.0 mg/100 g的CPP，檢測的平均值分別為0.49 mg/100 g和119.6 mg/100 g，相對偏差分別為3.68%和1.89%。由表1可知，采用這種方法測定乳制品中的CPP質量分數具有很好的穩定性。方法的回收率如表2所示。

表1 乳制品的精密度試驗結果

表2 乳制品的回收率實驗結果

本研究對液奶和奶粉中的CPP的回收率進行了測定。在液奶和奶粉樣品中分別加入一定量的CPP，按1.3.4的方法進行樣品前處理，1.3.1所述的色譜條件進行測定，測得液奶中CPP的加標回收率為96%，奶粉中CPP的加標回收率為97.1%，均有較好的結果。

3 結論

本方法將純化后的CPP原料作為標準品，以保留時間定性，外標法定量，進行了乳制品中CPP質量分數的高效液相色譜測定法。采用該方法使乳制品中的CPP得到很好地分離，且能夠準確定量測定強化了CPP的乳制品中CPP的質量分數。該方法前處理簡單，實驗條件準確可靠，不僅可以用來測定乳制品的CPP質量分數，而且對分析乳制品中所含的其他蛋白類物質的分析測定也具有一定的指導意義。

[1]馮鳳琴,王博誠,倪莉,等.酪蛋白磷酸肽(CPP)分離純化及分子結構的鑒定[J].無錫輕工大學學報,1999,18(4):33-37.

[2]馮鳳琴,王博誠,許時嬰,等.酪蛋白磷酸肽對切除卵巢后老齡雌性大鼠骨密度的影響[J].營養學報,2003,25(1):98-100.

[3]陳亞非,陳金星,朱韶娟,等.酪蛋白磷酸肽促進人體鈣吸收的作用研究[J].食品科學,2002,23(4):130-132.

[4]牟光慶,張麗萍,王立民,等.毛細管區帶電泳測定酪蛋白磷酸肽方法的研究[J].中國食品學報,2002,2(2)：21-24.

[5]林嶸，周杏琴.毛細管電泳在HPLV制備分離酪蛋白磷酸肽中的應用。國外分析儀器，2000，（3）：41-43.

[6]賴奕堅,陳閩軍,劉玉敏，等.LC-MS法測定鈣片中酪蛋白磷酸肽含量[J].食品科學，2006，27（12）：672-674.

[7]馮鳳琴,陳閩軍,杜永盛，等.高效液相色譜法測定奶粉中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量[J].中國食品學報，2006，6（3）：128-131.

[8]龐廣昌，朱文欣，陳慶森.酪蛋白磷酸肽（CPPs）測定方法的研究[J].食品科學，2001，22（5）：49-52.

[9]王玉瑩，陳錫威，馮風琴，等.酪蛋白磷酸肽的研究進展[J].食品工業，2014，35（5）：204-208.

Determination of casein phosphopeptide in dairy products by high performance liquid chromatography

LIANG Yan1,SHI Dan1,WANG Yan-ping2
(1.Inner Mongolia Research Institute of dairy technology C.,Ltd,Hohhot 010100,China;2.Inner Mongolia Yili Industri?al Group Co.,Ltd.liquid milk Business Unit research&development department，Hohhot 010100,China)

A high performance liquid chromatography(HPLC)method was developed and applied to determine casein phosphopeptide（CPP）in dairy products.Extraction and purification from samples were made before HPLC analysis.Excellent separation of CPP was achieved.The developed method proved to be simple,safe,accurate,reliable and reproducible.

high performance liquid chromatography(HPLC);dairy products;casein phosphopeptide（CPP）

TS252.7

A

1001-2230（2016）09-0056-02

2016-01-12

梁艷(1982-)，女，工程師，研究方向為乳品開發。