局部晚期宮頸癌細胞中乏氧誘導因子-1α表達及其與預后的關系

謝福川,邵汛帆,白力

(1. 廣州醫科大學附屬腫瘤醫院 放療科,廣東 廣州 510095; 2.廣東惠州中心人民醫院 腫瘤放射治療中心,廣東 惠州 516001)

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局部晚期宮頸癌細胞中乏氧誘導因子-1α表達及其與預后的關系

謝福川1,2,邵汛帆1,白力2

(1. 廣州醫科大學附屬腫瘤醫院 放療科,廣東 廣州 510095; 2.廣東惠州中心人民醫院 腫瘤放射治療中心,廣東 惠州 516001)

目的 觀察宮頸鱗癌細胞中乏氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達情況及其與預后的關系。方法 通過治療前檢測119 例宮頸鱗癌患者HIF-1α的表達情況,并分析陽性、陰性表達組放化療療效并研究其與宮頸癌預后的關系。結果 119例中晚期宮頸鱗癌患者中HIF-1α表達陽性者86 例(72.3%)，表達陰性者33 例(27.7%)。Ⅱ、Ⅲ期患者表達陰性者的有效率(94.7%、85.7%) 高于表達陽性者(87.8%、75.6%)，差異有統計學意義(P=0.032,P=0.041)；表達陰性者(89.4%、78.5%)2 年局控率高于表達陽性者(75.5%、70.2%)，差異有統計學意義(P=0.021、P=0.035)；表達陰性者2年生存率(100%、85.7%)高于表達陽性患者(91.2%、72.9%)，差異有統計學意義(P=0.034、P=0.041)。結論 大部分中晚期宮頸鱗癌細胞HIF-1α表達陽性，對于Ⅱ、Ⅲ期患者HIF-1α表達陽性與不良預后相關。

乏氧誘導因子-1α; 宮頸癌細胞; 表達; 預后

宮頸癌是嚴重威脅女性健康的一種惡性腫瘤，發病率占我國婦女生殖系統惡性腫瘤的首位[1]。宮頸癌根據組織學可分為鱗狀細胞癌、腺癌、混合癌等，其中鱗狀細胞癌占絕大多數。早期宮頸癌多無明顯癥狀，大多數宮頸癌出現陰道流血等癥狀進行診治時已處于中晚期狀態。目前臨床上治療宮頸癌的主要方式為手術治療及同步放化療，早期宮頸癌治療以單純手術或單純放療為主，二者療效均良好，有效率相當，5年生存率超過90%。局部晚期宮頸癌患者因存在腫瘤體積大、淋巴結擴散、分化程度低等轉移和復發的高危因素，若單純進行放療或手術治療無法取得較好的療效，患者整體生存率不高。同期放化療是局部晚期宮頸癌的根治性治療手段，可有效降低宮頸癌的局部復發及遠處轉移率[2]。大多數人類實體腫瘤微環境中存在缺氧狀態，缺氧能誘發局部新血管生成、腫瘤擴增和復發，對治療效果造成較大影響[3]。已有研究發現缺氧狀態下激活的核轉錄因子：乏氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha)是維持機體氧穩態，調節組織或細胞適應乏氧、介導細胞存活的重要調控因子，幾乎調控了缺氧所誘導的所有基因的轉錄。腫瘤的進展及對放化療的抗拒和不良預后與乏氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的過度表達有關[4]。檢測腫瘤細胞中HIF-1α的表達情況，能夠較好地評估腫瘤細胞的乏氧程度，進一步了解HIF-1α與腫瘤預后的關系。本文分析本中心2012年1月至 2013年10月119例局部晚期宮頸癌患者治療前所檢測的HIF-1α表達情況，探討其與宮頸癌療效及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集惠州中心人民醫院腫瘤放射治療中心2012 年1月至2013年10月119例中晚期宮頸癌患者。均采用FIGO(2009年)臨床分期，根據HIF-1α表達情況分為陽性表達組及陰性表達組。符合以下條件：①均經病理組織學確診為宮頸鱗狀細胞癌。②臨床分期Ⅱ～Ⅲ期，均未進行過放化療，既往無惡性腫瘤病史。③年齡<70歲。④KPS評分≥70分。治療前所有患者血常規、肝、腎功能均正常，無遠處器官轉移情況。病例總數119例，其中Ⅱ期68例，Ⅲ期51例。年齡29～69歲之間，中位年齡49歲。

1.2 治療方法

119例宮頸鱗癌患者均采用同期放化療。

根治性放療：先采用6MV-X 線盆腔二維外照射，前后對穿大野照射DT 30 Gy(每周5 次，每次2 Gy，連續3周，共15次)，后改四野照射DT 20 Gy(每周5 次，每次2 Gy，連續2周，共10 次；射野界限不變，僅在全盆腔照射野中央擋3～4 cm 寬鉛塊)。當盆腔大野照射20 Gy 后即開始同期采用192 Ir 后裝機行腔內放療，A 點劑量每次6 Gy，每周1 次，總劑量DT 36～42 Gy，共照射6～7 次，腔內照射當天不進行體外照射。

同期化療：在放療開始后，每周給予單藥順鉑40 mg/m2同期化療，每周1 次，連用6 次。

1.3 實驗方法及主要試劑

兔抗人HIF-1α單克隆抗體、DAB顯色劑以及SABC工作液試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。染色方法參照其說明進行。染色20min后，免疫組化步驟按照二步法說明書進行實驗操作。病理切片常規進行脫蠟、水化，使用檸檬酸高壓抗原修復，采用DAB溶液顯色，蘇木素進行復染。

1.4 結果判斷

1.4.1 鏡下觀察 以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)作為一抗陰性對照，預試驗陽性片作為陽性對照。HIF-1α陽性表達主要定位于細胞核，呈棕黃色細顆粒狀著色，以細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞即HIF-1α表達陽性。隨機選取400倍顯微鏡下5個不同視野，各計數100個癌細胞，共計500個細胞，按陽性細胞數>50%強陽性(+++)，26%～50%陽性(++)，11%～25% 弱陽性(+)和< 10%為陰性(-)，每個視野中宮頸癌細胞同時進行評分，強陽性(+++) 為9～12分，中度陽性(++)為5～8 分，弱陽性(+) 為 1～4 分，陰性(-) 為0分，得分=5個視野評分總和的平均數，得分<5分病例納入HIF-1α陰性組，得分≥5分病例納入HIF-1α陽性組[5]。

1.4.2 療效評定指標 治療結束后4周進行評價，分別評價近期療效和遠期療效。對比治療前后婦科檢查及盆腔CT、MRI、PET/CT 等檢查的改變，按照WHO實體瘤療效標準評定。完全緩解(CR)：病灶消失，且病灶的消失時間大于4 周；部分緩解(PR)：病灶(雙徑可測)2個最大直徑的乘積減少程度大于50%以上，且持續時間大于4 周；病變進展(PD)：產生新的病灶，病灶(單徑可測) 增大程度大于25% 或病灶(雙徑可測)2個最大直徑的乘積增大大于25%；病變穩定(SD)：介于部分緩解和疾病進展之間[6-7]。

1.5 觀察評價

1.5.1 近期療效 兩組病人治療結束后按照實體瘤療效評價，CR+PR評定為有效，其中近期治療的總有效率=[CR+PR]/總例數。

1.5.2 遠期療效 2年局部控制率(CR+PR+SD)及生存率：生存時間從第 1 次放療開始計算至末次隨訪或死亡為止，以月為計量單位。

1.6 統計學處理

統計分析采用 SPSS19.0 軟件分析，療效比較采用χ2檢驗，生存率的比較采用 log-rank 法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α表達情況

免疫組化技術檢測顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織細胞中的HIF-1α的陽性染色主要分布于癌細胞胞核內(見圖1)。全部患119例，表達陽性者86 例(72.3%)，Ⅱ期49例、Ⅲ期37例。表達陰性者33例(27.7%)，Ⅱ期19 例、Ⅲ期14例。

2.2 近期療效

治療結束 4周后評價患者近期療效。在Ⅱ 期、 Ⅲ 期患者中,表達陰者的有效率(94. 7%、 85.7%)高于表達陽性者(87.8%、 75.6%),差異有統計學意義(P=0.032,P=0.041) 。見表1。

2.3 遠期療效

Ⅱ期、Ⅲ患者中，表達陰性組2年局控率(89.4%、78.5%) 高于表達陽性者(75.5%、70.2%)，差異有統計學意義(P=0.027、P=0.029)；表達陰性組2年生存率(100%、85.7%) 高于表達陽性者(91.2%、72.9%),差異有統計學意義(P=0.034、P=0.041) 。見表2。

A.陽性表達; B.陰性表達。

圖1 宮頸鱗癌細胞HIF-1α的表達情況(免疫組化,400×)

Figure 1 Expression of HIF-1α in cervical cancer squamous cells (immunohistochemistry,400×)

表1 HIF-1α 表達陰性、陽性患者放化療后的有效率n(%)

Table 1 Effective rate in HIF-1α negative and positive expression groups

nⅡ期Ⅲ期HIF-1α表達陰性3318/19(94.7)12/14(85.7)HIF-1α表達陽性8643/49(87.8)28/37(75.6)χ24.4713.379P0.0410.032

表2 治療后2年局部控制率及生存率

Table 2 Local control and survival rates after 2 years of treatment in HIF-1α negative and positive expression groups

n(%)

3 討論

每年全世界大概有50萬新發宮頸癌患者，占新發癌癥的5%，其中大多數的新發病例產生在發展中國家，每年約有20多萬女性死于宮頸癌，我國每年約有新發病例13萬，占世界子宮頸癌新發病例總數的28%，宮頸癌好發年齡在35～39歲和60～64歲這兩個時間段，平均發病年齡為52.2歲，研究顯示其發病率在這些地區有上升趨勢，患者逐漸年輕化[8-9]。乏氧是腫瘤細胞微環境的特征之一，會刺激腫瘤細胞分泌多種促血管生成因子等，以促進血管的生成，改善腫瘤供血及營養供給，增強腫瘤細胞放射性、化學性損傷的修復。因此，乏氧狀態會增加腫瘤對放化療的抗拒性，降低放化療效果。

腫瘤乏氧在實體腫瘤中是一個常見的現象，實體腫瘤的氧分壓(PaO2)低于腫瘤起源的正常組織，是隨著瘤體增大和血供不充足所形成的重要生存微環境。為了適應乏氧，增加氧的利用和減少氧的消耗,快速分裂的腫瘤細胞許多基因的轉錄活性發生改變，相關研究發現乏氧在腫瘤的進展、遠處轉移，乃至腫瘤對放療、化療和光動力學治療抵抗等方面都起著極其重要的作用。臨床上存在部分患者接受放化療后療效不佳，主要原因與腫瘤細胞內存在乏氧細胞有關，乏氧細胞約占實體腫瘤總細胞數的10%～50%，其對放化療有抗拒性，無氧酵解供能能夠維持低氧細胞的存活功能，乏氧狀態得到改善后，即可分裂、增殖，成為以后腫瘤復發、轉移的根源。多項研究證明HIF-1α會降低惡性腫瘤的放射敏感性，HIF-1α通過抑制細胞凋亡及調控DNA 修復過程的因子表達，使電離輻射對腫瘤細胞DNA 的損傷無法固定；同時HIF-1α促進血管生成、無氧代謝，使逃離電離輻射物理殺傷的腫瘤細胞獲得必要的生存條件，最終降低放療敏感性[10]。HIF-1α參與腫瘤新生血管形成及轉移機制，在腫瘤的發展及侵襲轉移等方面發揮重要的作用[11]。梁少強等報道HIF-1α的表達分別與宮頸癌臨床分期、放療敏感性和骨、肺、肝等遠處轉移和5 年生存期有關[12]。

本研究顯示，HIF-1α在中晚期宮頸癌細胞中呈現高表達，119例中晚期宮頸癌細胞中的HIF-1α染色主要位于細胞核中，表達陽性者86 例(72.3%)，表達陰性者33 例(27.7%)。Ⅱ、Ⅲ期患者表達陰性者的治療有效率高于表達陽性者，差異有統計學意義。該結果可能與中晚期宮頸癌細胞中HIF-1α過表達，調節腫瘤細胞適應低氧的微環境的改變并促進新生血管生成，導致相關基因的轉錄增強有關，提示HIF-1α的高表達與宮頸癌療效有密切相關。另外，在局部晚期宮頸鱗狀細胞癌中HIF-1α陽性表達的患者治療后2年局控率及生存率較差，提示 HIF-1α陽性表達與宮頸癌患者的不良預后相關，HIF-1α陽性表達對判斷宮頸癌治療療效、復發及遠處轉移有參考意義，有助于進一步了解宮頸癌生物學行為，為臨床診治提供新的方向。未來通過使用針對性的靶向藥物沉默HIF-1α的表達來抑制腫瘤血管生長、降低腫瘤細胞能量供給、減少腫瘤細胞放化療損傷的修復，可能有助于提高宮頸癌患者治療效果。本研究初步分析了 HIF-1α對局部晚期宮頸鱗癌預后的影響作用，更長時間的生存觀察及確切的結果還需進一步的研究。

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(責任編輯：王昌棟)

Relationship between the expression of HIF-1α in locally advanced cervical cancer cells and this disease prognosis

XIE Fuchuan1,2,SHAO Xunfan1,BAI Li2

(1.DepartmentofCancerRadiotherapy,CancerCenterofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510095,China; 2.DepartmentofCancerRadiotherapyCentralofHuizhouMunicipalCenterHospital,Huizhou516001,China)

Objective To explore the relationship between the expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1α) in locally advanced cervical cancer cells and this disease prognosis. Methods A total of 119 patients with stage II-III cervical squamous cancer treated with concurrent chemo-radiotherapy were enrolled in this study. The expression of HIF-1α was detected by immunohistochemistry. The correlation between HIF-1α expression and disease prognosis was analyzed. Results The number of HIF-1α positive expression was 86 cases (72.3%),and the number of HIF-1α negative expression was 33 cases (27.7%). For stage Ⅱ and Ⅲ patients,the effective rate in HIF-1α negative and positive expression groups after treatment was (94.7%,85.7%) and (87.8%,75.6%),respectively. The difference was statistically significant (P=0.032,P=0.041). The local control rate after 2 years of treatment in HIF-1α positive group was significantly higher than that in the HIF-1α negative expression group (89.4%,78.5%vs75.5%,70.2%,P=0.021,P=0.035). The survival rate after 2 years of treatment in HIF-1α negative expression group was significantly higher than that in the HIF-1α positive expression group (100%,85.7%vs91.2%,72.9%,P=0.034,P=0.041). Conclusion HIF-1α is positively expressed in most of cervical squamous cancer cells,which is correlated with poor prognosis in stage Ⅱ and Ⅲ patients.

HIF-1 alpha; advanced cervical squamous cancer cells; expression; prognosis

2016-02-19

謝福川，男，碩士研究生，主治醫師，主要從事腫瘤放射治療研究,Email:95858301@qq.com;通信作者:邵汛帆(1963—),男,主任醫師,主要從事腫瘤放射治療,Email:xunfanshao@ hotmail.com。

時間：2016-11-25 14:18

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161125.1418.002.html

R737.33

A

1006-8783(2016)06-0801-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016021902