殼聚糖定量分析方法的研究進展

馬彩娟，張偉愛，白研

(廣東藥科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310)

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綜述

殼聚糖定量分析方法的研究進展

馬彩娟，張偉愛，白研

(廣東藥科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310)

殼聚糖(chitosan)是目前自然界唯一帶陽離子的堿性多糖，具有減肥降脂、增強免疫力等生物活性，使其在醫(yī)藥和功能性食品領(lǐng)域都備受關(guān)注，因此，以殼聚糖為核心成分的產(chǎn)品質(zhì)量控制是一個重要的研究課題。本文綜述了近年來殼聚糖定量分析的主要方法，包括光譜法、電化學(xué)法和高效液相色譜法等，并對其分析測定的發(fā)展進行展望，旨在為各類產(chǎn)品中殼聚糖的定量分析提供新的思路。

殼聚糖； 定量分析； 光譜法； 電化學(xué)法； 高效液相色譜法

甲殼素屬于天然多糖，廣泛存在于低等生物菌類、藻類的細胞，節(jié)肢動物蝦、蟹、昆蟲的外殼中，是由N-乙酰氨基葡萄糖縮聚而成的線性聚合物[1]。甲殼素多聚糖不溶于水及弱酸、弱堿性物質(zhì)，難以被人體吸收和利用。

1859年Rouget將甲殼素浸泡在高濃度KOH溶液中煮沸一段時間，取出后發(fā)現(xiàn)其可溶于有機酸中。1894年Hoppe-Seiler確認這種產(chǎn)物是脫掉部分乙酰基的甲殼素，并命名為殼聚糖(Chitosan)。所以，殼聚糖為甲殼素經(jīng)過強堿水解或酶解等化學(xué)法脫乙酰基(脫去55%以上)后形成的產(chǎn)物，是以β-(1,4)糖苷鍵串聯(lián)的氨基葡萄糖線性大分子，化學(xué)名稱是聚(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖[2]，圖1為甲殼素和殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)。殼聚糖天然無毒，具有生物相容性、生物降解性、易成膜性，屬于可食性動物纖維，并可被人體利用[2]。目前，醫(yī)學(xué)上已經(jīng)證實殼聚糖的主要功能包括降血脂[3]、抗腫瘤[4]、增強細胞免疫功能[5]和抑菌作用[6]，而且，殼聚糖與機體組織具有親和作用，不與體液起反應(yīng)，也無抗原作用。因此，殼聚糖在醫(yī)藥和功能性食品中有著廣泛的應(yīng)用，其核心成分殼聚糖的準確含量是非常重要的質(zhì)量指標。

殼聚糖為天然高分子，分子量和脫乙酰度為殼聚糖的兩大物理特征指標，其分子量從數(shù)千到數(shù)百萬不等，殼聚糖分子量越大，碳鏈越長，在弱酸條件下疏水性越強。一般而言，N-乙酰基脫去55%以上的就可稱之為殼聚糖，而市面上殼聚糖保健產(chǎn)品的脫乙酰度通常在85%以上，殼聚糖的脫乙酰度越大，溶解性越好。不同的殼聚糖產(chǎn)品之間可能存在殼聚糖分子量和脫乙酰度的差異，因此，建立準確定量分析殼聚糖的方法，對保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定和可控，具有十分重要的意義。

圖1 甲殼素(A)和殼聚糖(B)的結(jié)構(gòu)

Figure 1 Structure of chitin (A) and chitosan (B)

由于殼聚糖本身具有分子量大、黏度大、溶解度較差、易于降解、且紫外吸收較弱等特點，對其準確定量仍存在一定的困難。本文就國內(nèi)外文獻報道的殼聚糖定量分析方法進行綜述，旨在為各類樣品中殼聚糖準確定量的深入研究提供思路。目前，定量分析方法主要集中在光譜分析法，另有少量電化學(xué)法和高效液相色譜法。

1 光譜分析法

1.1 分光光度法

分光光度法測定殼聚糖含量具有操作簡單、方便、快速、經(jīng)濟，以及樣品不需要特殊前處理的優(yōu)點，該類方法應(yīng)用于殼聚糖的分析研究相對較早，也是研究成果最多的方法之一。殼聚糖本身不具有發(fā)色基團，不能通過分光光度法直接檢測，需要在弱酸性條件下，質(zhì)子化的氨基與帶負電荷的陰離子大分子(如酸性染料或者金屬試劑)通過靜電引力結(jié)合，體系吸光度的變化與殼聚糖的含量呈線性相關(guān)，從而定量測定殼聚糖的含量。早期使用茚三酮[7]及燦爛紅3B-A[8]為顯色劑，作為經(jīng)典方法，后來進行了不少相關(guān)的優(yōu)化研究[9-11]。近年來發(fā)展了更多基于大分子與殼聚糖結(jié)合的分光光度法，表1為近年來國內(nèi)外采用分光光度法在定量測定殼聚糖的研究成果。試驗中緩沖溶液的種類和加入量、pH值、試劑加入量、反應(yīng)時間、穩(wěn)定時間、溫度和試劑加入順序、離子強度等是建立方法的重要影響因素。

Mendelovits等[10]在Muzzarelli[8]實驗的基礎(chǔ)上對分光光度法進行了改進，使用了膠體法和離心法對殼聚糖定量，并將兩種方法進行了對比。膠體法是通過測定殼聚糖與燦爛紅3B-A的締合物的吸光度值進行定量；離心法是通過離心除去兩者形成的膠體沉淀，測定溶液中剩余的染料含量。研究發(fā)現(xiàn)膠體法在一定程度上會受到試劑空白的影響，但離心法可以避免染料的試劑空白對低濃度殼聚糖含量測定的影響，且線性較好。

表1 分光光度法測定殼聚糖

隨著研究的深入，殼聚糖的脫乙酰度和分子量對殼聚糖含量測定的影響也逐漸被研究者關(guān)注。鄭鐵生等[12]在利用溴甲酚綠為探針的分光光度法中發(fā)現(xiàn)脫乙酰度越大，含量測定的結(jié)果越高。白研等[13]利用活性紅4與殼聚糖形成的離子締合物對殼聚糖含量進行測定，并研究了殼聚糖分子量對其準確定量的影響，通過對比低分子量標準溶液與中分子量標準溶液對結(jié)果的影響，推斷出該測定方法不受分子量大小的影響，具有普遍適用性。盡管分光光度法操作簡便、快速，但總體來說，該類方法靈敏度較低，選擇性較差，部分金屬元素對體系可能存在干擾，影響殼聚糖的準確定量。

1.2 熒光淬滅法

迄今為止，熒光光度法測定殼聚糖含量均采用熒光淬滅法，熒光淬滅法是一種比直接熒光測定法更靈敏、選擇性更好的方法。該類方法是在弱酸性條件下，利用殼聚糖與帶有發(fā)光基團的陰離子大分子結(jié)合，破壞熒光物質(zhì)本有的剛性結(jié)構(gòu)，使體系的熒光強度降低，且與殼聚糖的含量和熒光強度的降低程度呈線性關(guān)系，以此來定量分析殼聚糖含量。近年來基于熒光淬滅法對殼聚糖定量分析的研究成果也較多，見表2。

表2 熒光光度法測定殼聚糖

韓美娜等[25]研究了在NaH2PO4-Na2HPO4溶液中，殼聚糖對異硫氰酸的熒光淬滅作用，發(fā)現(xiàn)吐溫-20對該體系有明顯的增敏作用，將殼聚糖的測定方法從兩元體系增加到三元體系。該方法干擾小，但線性范圍較窄。張偉愛等[26]研究發(fā)現(xiàn)了殼聚糖對活性紅4存在的熒光淬滅作用，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為λex/λem=285/341 nm，淬滅方式為動態(tài)淬滅，實驗中同時發(fā)現(xiàn)了殼聚糖-活性紅4締合物在342 nm處有強烈的共振瑞利散射峰，散射強度隨殼聚糖含量增加而增強，據(jù)此建立了以活性紅4為探針的熒光淬滅法和共振瑞利散射法，方法靈敏度較高，并將兩種不同的測定方法結(jié)果進行對比，應(yīng)用于實際樣品中，測定結(jié)果基本一致。總體來說，熒光淬滅法較分光光度法靈敏度高，方法穩(wěn)定性較好，但仍存在選擇性較差的問題，測定結(jié)果易受部分金屬離子的影響。

1.3 共振瑞利散射法

共振瑞利散射法是一種高靈敏度的分析測試技術(shù)，始于20世紀90年代初，是指當(dāng)瑞利散射位于或接近于分子吸收帶時，電子吸收電磁波頻率與散射頻率相同，電子因共振而強烈吸收光的能量并產(chǎn)生再次散射，其散射強度比單純的瑞利散射提高幾個數(shù)量級，并且不再遵循瑞利定律[27]。2007年，楊季冬等[28]首次應(yīng)用共振瑞利散射法用于殼聚糖的含量測定，探討了殼聚糖與蛋白質(zhì)在銅離子存在下的作用機理，發(fā)現(xiàn)Cu(Ⅱ)存在下，血清白蛋白與殼聚糖相互作用后RRS光譜強度劇增，同步熒光也發(fā)生變化。方法具有較高的靈敏度，可用于保健膠囊中殼聚糖測定。王玉微[29-30]應(yīng)用共振瑞利散射技術(shù)研究了殼聚糖分別與陰離子表面活性劑、染料分子(剛果紅、曲利本藍、茜素紅)、金屬鈰和金納米之間的相互作用，定量檢測殼聚糖的含量，結(jié)果令人滿意。

近年來，共振瑞利散射法因其操作簡便、靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點受到廣泛的關(guān)注并已成功運用到多個領(lǐng)域，是分析化學(xué)領(lǐng)域中一重要的分析技術(shù)，而利用共振瑞利散射法對殼聚糖的定量分析也有了新的進展。Zhang等[31-32]分別建立了以萘酚綠B和水溶性苯胺藍為探針的共振瑞利散射法，方法靈敏度高，準確性好。通過統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明，兩個體系中殼聚糖的準確定量不受分子量的影響，同時水溶性苯胺藍-殼聚糖體系中殼聚糖的準確定量還不受脫乙酰度的影響，具有普遍適用性。

1.4 紅外光譜法

紅外光譜法實質(zhì)上是一種根據(jù)分子內(nèi)部原子間的相對振動和分子轉(zhuǎn)動等信息來確定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和鑒別化合物的分析方法，在殼聚糖的定量分析上應(yīng)用較少，但適合于對殼聚糖復(fù)合物或衍生物的功能性基團的鑒別。殼聚糖的紅外光譜集中在中紅外區(qū)段，用其定量的重點在于某個基團的特征峰與殼聚糖濃度的變化存在線性關(guān)系。Tang[33]利用吡喃環(huán)上的次甲基的吸收峰(1 389和2 865 cm-1)面積比作為定量參照，建立了傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析方法，可應(yīng)用于藥物中的殼聚糖的含量，但線性較差。

2 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法具有裝置簡單，響應(yīng)快、成本低、線性范圍寬等特點，較早應(yīng)用于殼聚糖的定量分析。由于殼聚糖沒有電化學(xué)活性，需要與電化學(xué)探針如染料[34]、指示劑[35]等發(fā)生氧化還原反應(yīng)。國內(nèi)最早使用的方法為零電流電位滴定法，而近年來主要采用的是極譜法和伏安法。譚學(xué)才等[36]利用茜素紅S作為電化學(xué)探針，伏安法測定，發(fā)現(xiàn)在低濃度和高濃度殼聚糖中峰電流分別有線性增敏和減敏效應(yīng)。研究表明，由于殼聚糖的等電點是6.3，在pH為4.5的溶液中，殼聚糖分子有大量的氨基質(zhì)子化帶正電荷，殼聚糖與茜素紅S之間通過靜電作用和氫鍵作用結(jié)合，峰電流升高；而隨著殼聚糖濃度繼續(xù)增加，殼聚糖的雙螺旋結(jié)構(gòu)趨勢增加，分子間氫鍵形成，使得茜素紅分子鑲嵌到雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)部或被包裹在殼聚糖聚集體中，導(dǎo)致峰電流降低。Lu等[37]突破性發(fā)現(xiàn)殼聚糖的降解產(chǎn)物中的碳氧基團本身具有明顯的電活性，可在水銀電極下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，峰電流位于-0.62 V和-0.54 V，線性范圍寬，但靈敏度較低。該方法無需使用其他電活性物質(zhì)，可以直接對殼聚糖進行定量。但電化學(xué)方法靈敏度較低，方法穩(wěn)定性不佳，因而近年來，較少電化學(xué)法測定殼聚糖的報道。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法具有專屬性較強、準確性好、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點，其突出優(yōu)勢在于可以排除殼聚糖分子量和脫乙酰度差異帶來的干擾。目前，利用高效液相色譜法對殼聚糖定量分析主要分為2種，一種是直接對殼聚糖進行檢測，另一種是將殼聚糖水解為氨基葡萄糖(見圖2)，再通過測定氨基葡萄糖間接定量。

圖2 氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)

Figure 2 Structure of glucosamine

由于殼聚糖本身是一種大分子，弱紫外吸收且不具有熒光，對其直接測定，早年有采用氨基相柱分離，示差折光檢測器檢測[38]，雖然避免了氨基葡萄糖需要柱前衍生化等繁瑣的步驟，但是設(shè)備要求較高，不利于推廣使用。

國內(nèi)外較多研究定位于將殼聚糖水解后，對水解產(chǎn)物氨基葡萄糖進行檢測。氨基葡萄糖本身的極性較強，若利用常規(guī)的反相色譜法直接測定，保留時間短，不能達到較好的分離效果，因而通常需要先進行衍生化反應(yīng)，得到衍生化產(chǎn)物極性降低，且?guī)в邪l(fā)色基團或熒光基團，再上機檢測。普遍采用反相柱為碳十八柱，紫外檢測器或熒光檢測器檢測，常用的衍生化試劑主要有9-芴甲氧羰酰氯[39-41]、異硫氰酸苯酯[42]、鄰苯二甲醛[43]。近年來，還有液質(zhì)聯(lián)用的報道，吳治將[44]用高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法測定保健品中的甲殼素，先將樣品經(jīng)鹽酸水解，再進行萃取，洗脫等前處理，以碳十八色譜柱和乙腈-0.1%甲酸水流動相體系進行梯度洗脫，采用電噴霧負離子多反應(yīng)監(jiān)測模式測定，方法靈敏度高，選擇性好。最新研究表明，氨基葡萄糖也可用正相色譜直接檢測，Pesek等[45]利用正相液相色譜法分別測定了從蝦殼分離出來的氨基葡萄糖和氨基葡萄糖膠囊中的氨基葡萄糖和軟骨素。實驗對分離出來的氨基葡萄糖進行固相萃取，可以避免基體效應(yīng)的影響，再采用二氧化硅氫化物填充的DH柱對氨基葡萄糖進行分離，梯度程序洗脫，質(zhì)譜檢測器檢測其含量。構(gòu)建的方法免去了衍生化的繁雜步驟，避免了多重反應(yīng)帶來的實驗誤差。

對于間接法測定殼聚糖，殼聚糖水解的過程是其定量分析的關(guān)鍵，如何提高水解產(chǎn)率，降低實驗成本，一直是研究者關(guān)注的重點。殼聚糖的降解方法很多[46]，常用的方法是酸水解，較其他方法水解更徹底。研究成果表明，用單一鹽酸(6 mol/L)水解，水解時間越長，水解溫度越高，水解產(chǎn)率也越高，且密封條件下水解，可有效防止碳鏈被氧化。但是當(dāng)溫度超過110 ℃,氨基葡萄糖碳鏈會發(fā)生斷裂，碳化較為嚴重，故溫度不宜超過110 ℃。Li等[40]在試驗中改良了酸水解的方法，在110 ℃下使用HCl-H3PO4(4.5∶1.5,摩爾比)對殼聚糖水解24 h，結(jié)果表明該方法的回收率明顯比單一HCl水解的回收率高，結(jié)果滿意。

但是，高效液相色譜法必須經(jīng)過長時間的水解過程，水解產(chǎn)率不穩(wěn)定，且需要柱前衍生化，操作較為繁瑣，設(shè)備要求較高，實驗條件的探討較為復(fù)雜，成本較高。再者，該法仍存在殼聚糖水解產(chǎn)率不高和敞開式水解變性的問題，殼聚糖含量的計算方法能否與光譜學(xué)方法取得一致的問題上還需要進一步深入研究和驗證。

4 其他方法

Beaudoin等[47]將殼聚糖進行酸水解，然后對水解后的氨基葡萄糖用高效毛細管電泳法和激光誘導(dǎo)熒光檢測器進行測定，操作較為復(fù)雜，受水解條件影響較大。Nitschke等[48]用多碘化合物與食用蘑菇中甲殼素或殼聚糖反應(yīng)生成不溶性多糖復(fù)合物，用凝膠成像系統(tǒng)測定該復(fù)合物的光密度，從而得出甲殼素或殼聚糖的含量，線性關(guān)系良好，檢測范圍0.5～5 mg/mL，但只適合用于蘑菇細胞提取物的殼聚糖的測定，應(yīng)用范圍窄。

5 小結(jié)及展望

隨著食品安全意識與食品質(zhì)量標準的提高，殼聚糖質(zhì)量標準的控制尤為重要。光譜法具有操作簡便，成本低、靈敏度較高等優(yōu)點，受到了研究者的廣泛關(guān)注，相對而言，分光光度法和熒光淬滅法的研究報道較多，但靈敏度均不如共振瑞利散射法，且易受共存物質(zhì)的干擾，選擇性較差。目前，使用共振瑞利散射法對殼聚糖的研究報道較少，將是今后研究發(fā)展的一大熱點。而紅外光譜法特殊作用在于對分子結(jié)構(gòu)和官能團的鑒別，較適合于殼聚糖類衍生物特征組分的分析。電化學(xué)方法操作簡單、線性范圍寬，但其靈敏度和穩(wěn)定性均不夠理想。高效液相色譜法通常建立在殼聚糖的水解及衍生化的基礎(chǔ)上，專屬性好、靈敏度高且選擇性好，殼聚糖水解和氨基葡萄糖的柱前衍生化是2個關(guān)鍵步驟，殼聚糖水解不完全將影響測定結(jié)果的準確性。

再者，殼聚糖是一種天然高分子化合物，分子量和脫乙酰度是其兩大物理特性，在利用靜電結(jié)合作為定量基礎(chǔ)的情況下，僅有脫去乙酰基的氨基能與陰離子的分子結(jié)合，部分乙酰氨基并不能與陰離子分子結(jié)合。當(dāng)實際樣品中殼聚糖分子量及脫乙酰度與標準品的分子量及脫乙酰度存在較大差異時，檢測結(jié)果可能存在一定的系統(tǒng)誤差。因此，定量分析方法的建立，必須考慮殼聚糖分子量和脫乙酰度的影響。目前的電化學(xué)法和光譜學(xué)檢測方法普遍忽略了殼聚糖本身性質(zhì)對其準確定量的影響。高效液相色譜法是在殼聚糖水解后對氨基葡萄糖進行定量分析，可以排除脫乙酰度和分子量對其準確定量的影響，在這方面具有明顯優(yōu)勢，但是，如何使殼聚糖水解完全仍然是一大難題。

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(責(zé)任編輯：王昌棟)

Progress on the quantitative analysis of chitosan

MA Caijuan,ZHANG Weiai,SU Zhengquan,BAI Yan

(SchoolofPublicHealth,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510310,China)

Chitosan is currently the unique cationic alkaline polysaccharide in nature,with the function of reducing weight,strengthening immunity and so on,which has attracted much attention in the field of medicine and functional foods. Thus,the quality control of chitosan products becomes an important topic. This paper reviews the main technology on quantitative analysis of chitosan,including spectrophotometry,electrochemistry and high performance liquid chromatography (HPLC),etc. In order to provide a new way of thinking for the quantitative analysis of the chitosan in various samples,the development of the determination of chitosan is prospected.

chitosan; quantitative analysis; spectrophotometry; electrochemistry; high performance liquid chromatography

2016-09-05

國家自然科學(xué)基金項目(81173107)

馬彩娟(1991—)，2014級碩士研究生，主要從事環(huán)境與職業(yè)衛(wèi)生監(jiān)測，Emali:mcjane2013@163.com；通信作者：白研(1970—)，教授，主要從事衛(wèi)生檢驗與藥物分析研究，Email:angell_bai@163.com。

時間：2016-11-25 14:35

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161125.1435.003.html

R284.1;O65

A

1006-8783(2016)06-0805-06

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016090503