轉基因抗蟲棉花基因類型及原理研究進展

孫璇，馬燕斌，張樹偉，段超，王新勝，李燕娥

（山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000）

轉基因抗蟲棉花基因類型及原理研究進展

孫璇，馬燕斌，張樹偉，段超，王新勝，李燕娥

（山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000）

評述了蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因、蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、植物外源凝集素類基因、RNA干擾技術涉及到的一些昆蟲來源基因等幾類抗蟲基因的抗蟲機理及其在轉基因棉花中的應用，并分析了抗蟲轉基因棉花研究目前存在的問題和發展趨勢。通過回顧總結我國轉基因抗蟲棉已取得的成果，以了解我國現階段轉基因抗蟲棉研究的進展程度，為進一步研究轉基因抗蟲棉提供方向。

棉花；轉基因；抗蟲基因

棉花（Gossypium hirsutum L.）隸屬于錦葵科（Malvaceae）棉屬（Gossypium），是世界上最主要的經濟作物之一，同時，其也是我國重要的經濟作物之一。隨著基因工程技術的快速發展，轉基因抗蟲棉得到了迅猛的發展。轉基因抗蟲棉基因類型主要有：蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）基因；蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白（Vegetative Insectidal Proteins，VIPs）基因；蛋白酶抑制劑（Proteinase Inhibitors，PIS）基因；植物外源凝集素（Lectins）類基因以及RNA干擾技術（RNAi）所涉及到的一些昆蟲來源基因等。

1 蘇云金芽孢桿菌殺蟲結晶蛋白（ICPs）基因

蘇云金芽孢桿菌殺蟲結晶蛋白是蘇云金桿菌芽孢形成時期所產生的一種特異殺蟲結晶蛋白，為130～160 kDa多肽，俗稱Bt殺蟲晶體蛋白或δ內毒素。Bt殺蟲晶體蛋白以原毒素形式存在于伴孢晶體內，經過體外堿解或者經過昆蟲腸道被蛋白酶水解為55～70 kDa或者更小的多肽，小多肽與敏感昆蟲腸道中上皮紋緣細胞的特異受體結合，進而破壞紋緣細胞滲透壓平衡，使細胞裂解，殺死敏感昆蟲[1-2]。

根據殺蟲譜的不同，將Bt殺蟲晶體蛋白基因分成Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ六大類，統稱為Cry基因，分別代表不同的殺蟲范圍。其中，CryⅠ對鱗翅目昆蟲幼蟲有特異性；CryⅡ對鱗翅目和雙翅目昆蟲有特異性；CryⅢ對鞘翅目昆蟲有特異性；CryⅣ對雙翅目昆蟲有特異性；CryV對鱗翅目和鞘翅目有特異性；Cry VI對線蟲有特異性。根據氨基酸序列的同源性，在每一類型下又可分為A，B，C等基因型[3-6]。現階段國內棉花Bt蛋白基因類型轉化事件如表1所示。

表1 棉花Bt蛋白基因類型

2 蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白（VIPs）基因

營養期殺蟲蛋白基因類型可分為：Vip1基因、Vip2基因、Vip3基因和Vip4基因。其中，Vip1和Vip2對鞘翅目葉甲科昆蟲有殺蟲特異性；Vip3對鱗翅目昆蟲有殺蟲特異性；Vip4是新發現的一類蛋白，其具體功能還不清楚；VIPs可能是通過與敏感昆蟲的柱狀細胞結合，使其破裂，從而使敏感昆蟲腸道受損死亡，起到殺蟲作用。

Syngenta公司將Vip3a20基因導入棉花獲得轉基因棉花COTl 02并進行注冊，COTl 02對棉鈴蟲、煙蚜夜蛾、粉紋夜蛾、秋茹蟲、甜菜夜蛾等鱗翅目害蟲具有較高的抗性[18-19]。2006年，浙江大學沈志成在實驗室合成Vip3基因載體，并申請專利（專利號CN1818067A），與山西省農業科學院棉花研究所等單位合作，將具有自主知識產權的Vip3基因與CrylA基因導入陸地棉，期望獲得對鱗翅目害蟲具有廣譜高抗的棉花品種[19-20]。

目前，我國已審定抗蟲棉品種14個，其中，單價棉11個：GK1（國抗1號）、GK12（國抗12號）、GK19（國抗19號）、GK22（國抗22號）、GK30（魯棉研16號）、GK95-1（晉棉26號）、GK46（晉棉31號）、GKz10（魯棉研15號）、GKz13（魯RH-1）、GKz6（中棉所38）和GKz8（南抗3號）；雙價棉3個：sGK321（SGK321）、sGK9708（中棉所41）、sGK5（新研96-48）。

3 蛋白酶抑制劑（PIS）基因

蛋白酶抑制劑（PIS）殺蟲時能與昆蟲消化道內消化酶相結合，形成穩定的酶抑制劑復合物，使消化酶水解作用削弱；同時酶抑制劑復合物還能作為一個負反饋信號使昆蟲厭食，雙重效應使昆蟲對蛋白利用率降低，減少食物攝取，最終導致營養缺乏，發育不正常或死亡[21]。與Bt殺蟲蛋白相比，PIS對昆蟲致死率較低，但是抗蟲譜更廣，使昆蟲相對來說不易產生抗性。目前，已從馬鈴薯、大豆、豇豆、玉米等植物中提取出多種能夠表達蛋白酶抑制劑的DNA或cDNA[22]。現階段轉基因抗蟲棉蛋白酶抑制劑基因型有：豇豆胰蛋白酶抑制劑（Cowpea Trysin Inhibitor，CpTI）基因，大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（Soybean Kunitz Trypsin Inhibitor，SKTI）基因，苦豆子胰蛋白酶抑制劑（Sophora alopecuroides L. trysin inhibitor SATI）基因。

3.1 豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）基因

豇豆胰蛋白酶抑制劑屬絲氨酸蛋白酶抑制劑類型，對鱗翅目的棉鈴蟲、煙草芽蛾、海灰翅夜蛾和玉米螟以及鞘翅目的玉米根葉甲、雜擬谷盜和四紋豆象，直翅目的蝗蟲等具有一定毒殺作用。

1998年，李燕娥等[23]將豇豆胰蛋白酶抑制劑CpTI基因轉入棉花，獲得對棉鈴蟲具有抗性的轉基因棉株。1999年，郭三堆等[9]采用花粉管通道法，將人工合成的GFM CryIA殺蟲基因和經過修飾的CpTI基因的高效雙價殺蟲基因，轉入到石遠321中棉所19號以及3517和541中國棉花生產品種中，首次獲得了雙價轉基因抗蟲棉株系。高越峰等[24]在實驗室通過對CpTI基因進行修飾得到Sck基因，2007年，與郭金英等[25]合作，通過花粉管通道注射獲得轉Bt＋Sck雙價基因抗蟲棉，其對棉鈴蟲的抗性顯著高于抗蟲對照品種sGK321。

3.2 大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（SKTI）基因

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（SKTI）可抑制多種昆蟲消化蛋白酶活性，尤其對鱗翅目昆蟲有較強的抑制作用，其對胰蛋白酶抑制力明顯強于豇豆胰蛋白酶抑制劑（CPTI）[24]；1999年，王偉等[26]將含有豌豆外源凝集素（Pealectin，P-Lec）基因和SKTI基因的雙價抗蟲基因轉入新陸早1號、新陸中2號、冀合321和遼9，獲得對棉鈴蟲幼蟲有較強抗性的雙價抗蟲棉。薛計雄等[21，27]將CpTI基因的5′端修飾添加了SKTI信號肽序列、3′端修飾添加滯留內質網信號肽序列，與Bt基因一起導入棉花，獲得了具有更高抗性的雙價轉基因抗蟲棉。

3.3 苦豆子胰蛋白酶抑制劑（SATI）基因

苦豆子胰蛋白酶對棉蚜具有較強的抗性[28]。2007年，翁琴[15]將Bt＋SATI基因導入棉花，獲得了具有更高抗性的雙價轉基因抗蟲棉。

4 植物外源凝集素類基因

植物外源凝集素是一種可以與糖蛋白特異性結合的蛋白質，被昆蟲取食后，不僅能與昆蟲消化道膜上的糖蛋白特異性結合，阻礙營養物質的吸收；而且還能促使昆蟲消化道內的細菌過量繁殖，使消化道發生病變，最終使得昆蟲拒食、生長停滯，直至死亡[22，29-30]。現階段轉基因棉花應用的基因型主要有：豌豆凝集素（P-Lec）基因和雪花蓮凝集素（GNA）基因。

4.1 豌豆凝集素（P-Lec）

豌豆凝集素（P-Lec）是從豌豆種子中分離純化出來的蛋白質，前凝集素原由275個氨基酸組成，經過內質網和蛋白體加工后形成178個氨基酸的β鏈和58個氨基酸的α鏈特定蛋白結構，可專一性結合甘露糖或葡萄糖殘基[31]。

4.2 雪花蓮凝集素（GNA）

雪花蓮凝集素（GNA）是從雪花蓮中分離純化出來的四聚體蛋白，由4個12 kDa的相同亞基組成，能專一性識別α-1，3和α-1，6連接的D-甘露糖殘基[30，32]。雪花蓮凝集素對同翅目的蚜蟲、葉蟬和稻飛虱具有一定的毒殺作用；對咀嚼式口器害蟲具有中等毒殺作用[25]。

1999年，王偉等[26]將含有豌豆外源凝集素基因和SKTI基因的雙價抗蟲基因轉入新陸早1號、新陸中2號、冀合321和遼9，獲得了對棉鈴蟲幼蟲有較強抗性的雙價抗蟲棉。2003年，劉志等[10]將Bt＋GNA雙價基因通過花粉管通道法轉入蘇棉16號，從而獲得轉基因植株TL1的純合株系，TL1與6個感蟲的常規品種配制正、反交組合，F1都高抗棉鈴蟲。2005年，吳霞等[13]將Bt-CpTI-GNA三價基因導入棉花，獲得抗棉鈴蟲棉株。

5 RNAi技術涉及到的一些昆蟲來源基因

RNAi作用的基本過程主要分為3步：第1步，雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）導入細胞被RNaseIII家族中的Dicer酶剪切成小RNA（small interference RNA，siRNA）。第2步，siRNA與相關蛋白結合形成RISC（RNA-induced silencing complex）復合體，RISC復合體含有解旋酶、核酸內切酶等。siRNA與RISC結合后，siRNA被解旋酶打開形成單鏈結構。第3步，RISC上的單鏈RNA能特異性與其互補的靶標mRNA序列相結合，然后由RISC上核酸內切酶將靶標mRNA序列切割成21～23 nt小片段，從而使翻譯停止，即轉錄后基因沉默。RISC上的單鏈RNA稱為導向鏈（guide strand），導向鏈核酸序列通過堿基互補只能和與其同源的靶標mRNA結合，從而決定了RNAi效應的特異性[33-34]。

Mao等[35]培育了轉棉鈴蟲cyp6ae14基因棉花、煙草、擬南芥，其中，cyp6ae14基因編碼能使棉鈴蟲對棉酚產生抗性棉酚代謝蛋白。棉鈴蟲取食轉基因植物后腸中cyp6ae14基因轉錄水平大幅降低，CYP6AE14蛋白翻譯水平下降，使棉鈴蟲對棉酚的耐受力降低，進而營養不良，生長緩慢，直至死亡。

2013年，熊葉輝[33]通過農桿菌介導，將棉鈴蟲蛻皮調節轉錄因子HaHR3基因的Fragmentl目的片段轉入三生煙和珂字棉，得到陽性轉基因植株，以陽性單拷貝煙草飼喂棉鈴蟲，取食48 h后棉鈴蟲HaHR3基因被有效沉默，棉鈴蟲HaHR3蛋白表達亦被有效抑制，棉鈴蟲體質量增長緩慢、發育畸形，與對照組相比，死亡率、化蛹率及羽化畸形率表現出顯著性差異。同時還首次從棉鈴蟲中克隆并鑒定出Ha-sil-1和Ha-sil-2基因序列片斷，其對棉鈴蟲可能存在系統性干擾效應。

6 轉基因抗蟲棉花研究存在的問題與發展趨勢

Bt抗蟲基因是使用最早、最廣泛，也是最有效的基因，目前，在生產上使用的轉基因抗蟲棉大多是轉Bt抗蟲基因。隨著轉基因抗蟲棉大量種植，一些昆蟲開始對其產生抗性。張浩男[36]報道，在黃河流域田間監測出棉鈴蟲對轉基因抗蟲棉已產生早期抗性，一旦棉鈴蟲對抗蟲棉產生抗性，抗蟲棉將失去價值。通過轉入雙價基因或多價基因，可有效延緩棉鈴蟲對轉基因棉花產生抗性的時間。目前，轉基因抗蟲棉僅對鱗翅目昆蟲中棉鈴蟲、菜青蟲有較為理想的毒殺效果，對棉蚜、紅蜘蛛、棉葉螨、棉盲蝽等棉田主要害蟲不能有效控制。轉基因抗蟲棉抗蟲譜具有一定的局限性。

通過RNAi技術，可以針對某一種害蟲找出特異性基因進行單一性防治，也可以找出某一類共同基因進行廣譜性防治。RNAi技術非常有效地拓寬了抗蟲譜，也是轉基因抗蟲棉研究的熱門途徑。

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Research Progress on the Gene Types and Principles of the Transgenic Insect Resistant Cotton

SUN Xuan，MA Yan-bin，ZHANG Shu-wei，DUAN Chao，WANG Xin-sheng，LI Yan-e
（Institute of Cotton，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Yuncheng044000，China）

The mechanisms of several important insect resistant genes about Insecticidal Crystal Proteins,Vegetative Insectidal Proteins,Proteinase Inhibitors,Lectins,insect and their applications in developing transgenic insect resistant cotton were summarized. The existing problems and developing tendency of the transgenic insect resistant cotton were analyzed and discussed.The results of transgenic insect resistant cotton in China were summarized,which will understand the research progress of transgenic insect resistant cotton at the present stage in China,provide the direction for further research on transgenic insect resistant cotton.

cotton;transgene;insect resistant gene

S562

A

1002-2481（2016）01-0115-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.30

2015-08-28

國家轉基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08010-003）；國家自然科學基金項目（31201253）

孫璇（1989-），女，山西運城人，研究實習員，主要從事轉基因棉花研究工作。李燕娥為通信作者。