纖維素酶法提取百里香黃酮的工藝優化研究

王娣，柯春林，曹珂珂，謝海偉，李妍

(蚌埠學院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

纖維素酶法提取百里香黃酮的工藝優化研究

王娣，柯春林，曹珂珂，謝海偉，李妍

(蚌埠學院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

利用纖維素酶對百里香中黃酮進行了提取工藝研究。考察了酶解溫度、酶量、pH和酶解時間對黃酮得率的影響。百里香黃酮最佳提取工藝：酶解溫度45 ℃，酶量0.2%，pH 5.0，酶解時間1.5 h，黃酮得率可達1.528%。抗氧化實驗表明百里香黃酮具有較強的抗氧化活性，黃酮提取物濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達73.84%，對羥基自由基的清除率為51.73%。

纖維素酶；黃酮；正交試驗；抗氧化

百里香(Thyme)，別稱麝香草，為唇形科百里香屬植物，原產地中海沿岸，為西方珍貴的香辛調味料，在我國多分布在內蒙古、甘肅、陜西、青海、寧夏等地[1]。其所含精油因成分獨特，在醫藥、日用化工及精細化工等領域廣泛應用[2-4]。百里香莖葉中富含百里香酚、黃酮等活性成分，近年來又成為食品工業中保鮮劑、抗氧化劑、穩定劑等的理想替代品[5-8]。

纖維素酶是一組能夠降解纖維素酶的總稱，可破壞細胞壁的致密結構，消除胞內黃酮等大分子溶出的屏障，加速有效成分的溶出[9]。近年來，使用纖維素酶進行植物有效成分的提取取得了不少新的成果[10-13]。本課題擬采用單因素和正交試驗法優化提取條件，考察酶解溫度、酶量、pH、酶解時間等因素對百里香黃酮提取的影響，并對黃酮提取物的抗氧化活性進行初探，以期為百里香黃酮的進一步開發與應用提供有價值的參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

百里香 安徽亳州醫藥公司，粉碎，過60目篩。纖維素酶 上海潤捷化學試劑有限公司；蘆丁標準品(分析純) 上海生化試劑廠；DPPH(分析純) Sigma 公司。

DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；UV1102紫外-可見分光光度計 上海天普紫外可見分光光度計有限公司；DY881-8恒溫干燥箱 合肥愛拓實驗器材公司；JA2003A電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；HH-1(HH-5)恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司；RE-52旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

準確稱取2.00 g百里香粉，加入纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液混合，在不同纖維素酶濃度、酶解溫度和pH條件下酶解后，95 ℃維持10 min，使酶滅活；接著加入等體積無水乙醇浸提24 h后過濾，濾渣再加入50%乙醇20 mL浸提24 h過濾，合并濾液備用。

1.2.1 黃酮含量的測定

1.2.1.1 蘆丁標準工作曲線的繪制

準確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.020 g，用30%乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，得質量濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標準液。準確吸取蘆丁標準溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL還原6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL絡合6 min，加入質量分數為4%(即1 mol/L)的NaOH溶液4 mL，最后用30%乙醇定容，搖勻，顯色15 min，在波長510 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度C為橫坐標，得到蘆丁標準曲線。

1.2.1.2 提取物中黃酮含量的確定

準確吸取樣液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL還原6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL絡合6 min，加入質量分數為4%(即1 mol/L)的NaOH溶液4 mL，最后用30%乙醇定容，搖勻，顯色15 min，在波長510 nm處測定吸光度。從標準曲線方程中計算出黃酮含量，進而計算出黃酮得率。

式中：C為測得的樣品溶液的黃酮濃度(mg/mL)；K為樣品溶液的稀釋倍數；V為測定液總量(mL)；M為樣品的質量(g)。

1.2.2 單因素和正交試驗

1.2.2.1 酶解溫度對百里香黃酮得率的影響

準確稱取2.00 g百里香粉，加入0.2%的纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液(pH 4.6)，不同溫度(35，40，45，50，55 ℃)下水解1.5 h，95 ℃維持10 min，使酶滅活；加入等體積無水乙醇浸提24 h過濾，濾渣再加入50%乙醇20 mL浸提24 h過濾，合并濾液備用。考察不同酶解溫度對百里香黃酮得率的影響。

1.2.2.2 酶量對百里香黃酮得率的影響

準確稱取2.00 g百里香粉，按不同質量比(0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%)添加纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液(pH 4.6)，45 ℃下水解1.5 h，以下操作同上。考察不同酶量對百里香黃酮得率的影響。

1.2.2.3 pH對百里香黃酮得率的影響

準確稱取2.00 g百里香粉，加入0.2%的纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液(pH分別為4.2，4.6，5.0，5.4，5.8)，45 ℃水解1.5 h，以下操作同上。考察不同pH對百里香黃酮得率的影響。

1.2.2.4 酶解時間對百里香黃酮得率的影響

準確稱取2.00 g百里香粉，加入0.2%的纖維素酶和10 mL的HAc-NaAc緩沖液(pH 4.6)，45 ℃下水解不同時間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)，以下操作同上。考察不同酶解時間對百里香黃酮得率的影響。

1.2.2.5 正交試驗設計

正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表L9(34)
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平A酶解溫度(℃)B酶量(%)CpHD酶解時間(h)1400.14.21.02450.24.61.53500.35.02.0

1.2.3 百里香提取物抗氧化活性研究[14,15]

1.2.3.1 百里香提取物對DPPH自由基的清除能力

將百里香提取液減壓濃縮，真空冷凍干燥，得到黃褐色粉狀提取物，用無水乙醇溶解。將待測的百里香提取物溶液稀釋成系列溶液，添加6.5×10-5mol/L DPPH·乙醇溶液，避光反應10 min，在517 nm波長下測定吸光值。

清除率(%)=[1-(A2-A1)/A0]×100。

式中：A0為2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH·乙醇溶液+0.5 mL無水乙醇的吸光值；A1為2.5 mL無水乙醇+0.5 mL樣品溶液的吸光值；A2為2.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH·乙醇溶液+0.5 mL樣品溶液的吸光值。

1.2.3.2 羥自由基實驗

羥基自由基是一種強氧化劑，對羥基自由基的清除率是反映提取物抗氧化作用的一項重要指標。反應體系中加入鄰二氮菲，鄰二氮菲-Fe2+被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，紅色褪去，在536 nm處的吸收大幅度下降。將百里香粉狀提取物用無水乙醇溶解，稀釋成系列溶液。按表2加樣，37 ℃保溫60 min，于波長536 nm處測吸光度(A)值(3次平均)，計算羥自由基清除率。

表2 實驗加樣表及相應的吸光值Table 2 Sampling table of experiments and the corresponding absorbance

2 實驗結果與分析

2.1 蘆丁標準工作曲線

以吸光度為橫坐標，蘆丁濃度(μg/mL)為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1。得回歸方程y=0.0115x+0.0063，R2= 0.9997，具有良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶解溫度對百里香黃酮得率的影響

圖2 酶解溫度對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on the yield of flavonoids

由圖2可知，開始隨著溫度的升高，黃酮的得率也不斷地增大；當溫度達到45 ℃時，黃酮得率達到最大1.453%；再隨著溫度的升高，黃酮得率則出現了下降趨勢。因此，選定40，45，50 ℃為溫度對總黃酮得率較敏感的3個水平。

2.2.2 酶量對百里香黃酮得率的影響

圖3 酶量對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on the yield of flavonoids

由圖3可知，黃酮得率先隨著酶加量的增加而增大，當酶量添加到0.2%時，得率達到最大值并趨于穩定；再增加酶用量，增幅效果不明顯。因此，選定0.1%，0.2%，0.3%為酶量對總黃酮得率較敏感的3個水平。

2.2.3 pH對百里香黃酮得率的影響

圖4 pH值對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of pH value on the yield of flavonoids

由圖4可知，隨著pH值的升高，黃酮得率逐漸增大，當pH為4.6時，得率最高；再增大pH值，黃酮得率則呈現下降的趨勢。因此，選定4.2，4.6，5.0為pH對總黃酮得率較敏感的3個水平。

2.2.4 酶解時間對百里香黃酮得率的影響

圖5 酶解時間對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on the yield of flavonoids

由圖5可知，隨著酶解反應時間的延長，黃酮得率逐漸增大，當達到1.5 h時，黃酮得率達到最大，這說明此時酶和底物已經充分反應；當時間繼續增加時，黃酮得率增幅很小，趨于穩定。因此，選定1.0，1.5，2.0 h為提取時間對總黃酮得率較敏感的3個水平。

2.3 正交試驗結果與分析

表3 正交設計與試驗結果
Table 3 The orthogonal array design matrix and experimental results

序號酶解溫度(℃)酶量(%)pH酶解時間(h)黃酮得率(%)111110.986212220.997313331.072421231.319522311.473623121.326731321.128832131.056933210.795k11.0181.1441.1231.085k21.3731.1751.0371.150k30.9931.0641.2241.149極差r0.3800.1110.1870.065

表4 正交試驗結果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experimental results

因素偏差平方和自由度方差F比顯著性酶解溫度0.27020.13533.750*酶量0.02020.0102.500pH0.05320.0276.625酶解時間0.00820.0041.000誤差0.012

注：F0.05(2,2)=19。

由表3和表4可知，纖維素酶法提取百里香黃酮的影響因素依次為酶解溫度>pH值>酶量>酶解時間。由表4可知，酶解溫度對黃酮提取的影響顯著，而pH、酶量和酶解時間對黃酮得率的影響較小。確定了最佳提取條件為A2B2C3D2，即：在酶解溫度45 ℃，酶量0.2%，pH 5.0，酶解時間1.5 h的條件下，黃酮得率可達1.528%(3次平均)。

2.4 百里香提取物抗氧化實驗

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力

百里香黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力實驗結果見圖6，表明百里香黃酮提取物具有較強的抗氧化活性。隨著百里香黃酮提取物濃度的不斷增加，對DPPH自由基清除能力逐步增大。當提取物濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達73.84%。

圖6 百里香黃酮提取物清除DPPH自由基的量效關系Fig.6 The DPPH·scavenging effect of thyme flavonoids

2.4.2 對羥基自由基的清除能力

百里香黃酮提取物對羥基自由基的清除能力實驗結果見圖7，表明百里香黃酮提取物對羥基自由基有明顯的清除作用。隨著百里香黃酮提取物濃度的增加，對羥基自由基的清除作用也逐漸增強。當提取物濃度為1.0 mg/mL時，對羥基自由基的清除率為51.73%。

圖7 百里香黃酮提取物清除羥自由基的量效關系Fig.7 The ·OH scavenging effect of thyme flavonoids

3 結論

采用纖維素酶法可有效提取百里香黃酮。酶解溫度對百里香黃酮提取的影響最顯著，百里香黃酮的最優提取條件為：酶解溫度45 ℃，酶量0.2%，pH 5.0，酶解時間1.5 h，黃酮得率可達1.528%。抗氧化實驗表明百里香黃酮具有較強的抗氧化活性。對DPPH自由基的清除能力很強，當黃酮提取物濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達73.84%。隨著百里香黃酮濃度的增加，對羥基自由基的清除作用也逐漸增強。當黃酮提取物濃度為1.0 mg/mL時，對羥基自由基的清除率為51.73%。本實驗為初步抗氧化探究，旨在為百里香資源在我國的開發利用和發展提供一定基礎數據。

[1]中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒(第三冊)[M].北京：科學出版社,2002:681.

[2]Bensmira M, Jiang B, Nsabimana C, et al. Effect of lavender and thyme incorporation in sunflower seed oil on its resistance to frying temperatures[J].Food Research International, 2007, 40(3): 341-346.

[3]Solmakos N, Govaris A, Koidis P, et al. The antimicrobial effect of thyme essential oil, nisin, and their combination againstListeriamonocytogenesin minced beef during refrigerated storage[J].Food Microbiology, 2008, 25(1): 120-127.

[4]Iraj Rasooli, Mehdi Razzaghi Abyaneh. Inhibitory effects of thyme oils on growth and aflatoxin production byAspergillusparasiticus[J].Food Control,2004,15:479-483.

[5]Seung J L, Katumi U, Shibamoto T, et al. Identification of volatile components in basil(Ocimumbasilicuml)and thyme leaves(ThymusvulgarisL.)and their antioxidant properties[J].Food Chemistry, 2005 (91): 131-137.

[6]Chu C L, Liu W T, Zhou T. Fumigation of sweet cherries with thymol and acid to reduce post harvest brown rot and blue mold rot[J].Fruits, 2001 (56): 123-130.

[7]Solimana K M, Badeaab R I. Effect of oil extracted from some medicinal plants on different mycotoxigenic fungi[J].Food and Chemical Toxicology, 2002 (40): 1669-1675.

[8]Liu W T, Chu C L, Zhou T. Thymol and acetic acid vapors reduce post harvest brown rot of apricot and plums[J].Hort Science, 2001 (37): 151-156.

[9]劉智峰.酶法-超聲波輔助提取香椿葉中總黃酮及抗氧化活性研究[J].食品工業科技,2015(20):314-319.

[10]陳佳, 徐懷德, 米林峰,等.洋蔥皮總黃酮纖維素酶法提取及抗氧化研究[J].食品科學, 2011, 32(4): 37-41.

[11]方芳, 許凱揚, 朱強,等.超聲波輔助水酶法萃取葫蘆籽油的研究[J].中國糧油學報, 2012, 27(10): 62-66.

[12]施英英, 薛培儉, 夏黎明.酶法提取葛根渣中異黃酮的研究[J].林產化學與工業, 2006, 26(1): 62-64.

[13]王巖巖, 李文娟.纖維素酶提取陳皮黃酮的工藝條件[J].食品與生物技術學報, 2008, 27(2): 71-74.

[14]Paryathy K S, Negi P S, Srinivas P. Antioxidant, antimutagenic and antibacterial activities of curcumin-[betta]-diglucoside[J].Food Chemistry,2009,115:265-270.

[15]Liu H, Qiu N, Ding H, et al. Polyphenols contents and antioxidant capacity of 68 Chinese herbals suitable for medical or food uses[J].Food Research International, 2008, 41:363-365.

Study on Extraction Technology of Flavonoids from Thyme by Cellulase

WANG Di, KE Chun-lin, CAO Ke-ke, XIE Hai-wei, LI Yan

(Department of Biology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The extraction technology of flavonoids from thyme by cellulase is studied. The effects of enzymolysis temperature, enzyme amount, pH and enzymolysis time on the yield of flavonoids are investigated. The orthogonal experimental results show that the optimum extraction technology conditions of flavonoids from thyme by cellulase are as follows: enzymolysis temperature of 45 ℃, enzyme amount of 0.2%, pH of 5.0 and enzymolysis time of 1.5 h, the yield of flavonoids is 1.528%. The antioxidant experiments indicate that when the concentration of flavonoid extracts is 1.0 mg/mL, the clearance rate of DPPH·reaches 73.84%, and the clearance rate of OH·reaches51.73%.

cellulase; flavonoid; orthogonal experiment; antioxidant

2016-06-20

安徽省教育廳重點科研項目(KJ2015A204)

王娣(1976-)，女，副教授，碩士，研究方向：食品生物技術。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.009

1000-9973(2016)12-0038-05