食品中蠟樣芽孢桿菌平板計數的不確定度評定

吳衛玲，胡同靜，鐘君杰，徐振東

(1.江蘇省蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州 215104；2.江蘇省蘇州世標檢測技術有限公司，江蘇 蘇州 215104)

食品中蠟樣芽孢桿菌平板計數的不確定度評定

吳衛玲1,2，胡同靜1,2，鐘君杰1,2，徐振東1

(1.江蘇省蘇州出入境檢驗檢疫局，江蘇 蘇州 215104；2.江蘇省蘇州世標檢測技術有限公司，江蘇 蘇州 215104)

目的：為確保食品中蠟樣芽孢桿菌檢測結果的精確度。方法：依據GB 4789.14-2014中平板計數法對食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測結果進行不確定度的評定。結果：蠟樣芽孢桿菌檢測結果的擴展不確定度為0.28，當樣品中蠟樣芽孢桿菌平板計數法的檢測結果以平行樣對數值的平均值表示時，其取值區間為3.17±0.28。 結論：建立的方法評定的不確定度可適用于食品的合格性判斷。

食品；蠟樣芽孢桿菌；平板計數法；不確定度

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)廣泛分布于自然界，近年來在各類食品中的檢出率較高。蠟樣芽孢桿菌可產生不同毒素，引發食物中毒：一種是致吐型，是由于食品在食用前保存溫度不當，放置時間過長使污染在食品中的蠟樣芽孢桿菌或殘存的芽孢得以生長繁殖，并產生毒素而引發嘔吐；另一種是致腹瀉型，是由于食入較多蠟樣芽孢桿菌而產生的熱穩定毒素，導致食物中毒[1]。根據香港《食品微生物含量指引》：一般即食食品含超過105cfu/g蠟樣芽孢桿菌，可能危害食用者的健康或不宜供人食用[2]。目前已從多種食品中分離出該菌，包括肉、乳制品、蔬菜、魚、土豆、糊、醬油、布丁、炒米飯以及各種甜點等。在美國，炒米飯是引發蠟樣芽孢桿菌嘔吐型食物中毒的主要原因；在歐洲，大多由甜點、肉餅、色拉和奶、肉類食品引起；在我國，則主要與受污染的米飯或淀粉類制品有關。食品中蠟樣芽孢桿菌檢測采用平板計數法時，實驗過程包含諸多不確定因素。本實驗對在同一相對恒定實驗條件下，在同一時間段內，同一位檢測人員應用同一批次的培養基和試劑，對同一批樣品進行10次蠟樣芽孢桿菌檢測，對檢測結果進行不確定度評定。

1 原理與方法

1.1 原理

依據GB 4789.14-2014食品安全國家標準《食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》[3]第一法蠟樣芽孢桿菌平板計數法進行檢驗，程序見圖1。在同一相對恒定實驗條件下，同一位實驗人員對同一批次食品樣品進行檢測，對檢測結果進行不確定度評定。本次樣品為均勻并含可計算得出數目蠟樣芽孢桿菌的固體食品。

圖1 蠟樣芽孢桿菌平板計數法檢驗程序Fig.1 The testing program of Bacillus cereusby plate count method

1.2 檢測方法

1.2.1 樣品制備

取1 kg不含蠟樣芽孢桿菌的米飯于無菌取樣袋中，加入100 mL無菌生理鹽水，同時加入制備好的蠟樣芽孢桿菌標準菌株(ATCC11778)，用拍擊式均質器拍擊2 min，制成待測樣品。

1.2.2 樣品檢測

稱取25 g米飯置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打2 min，制成1∶10的樣品稀釋液。用1 mL滅菌微量移液器取1∶10樣品稀釋液1 mL，沿管壁緩緩注入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管內。振搖試管使其混勻，制成1∶100的樣品稀釋液，根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品稀釋液。每遞增稀釋1次，換用1支1 mL無菌吸頭。選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度以0.3，0.3，0.4 mL接種量，分別接種在3塊選擇性培養基——甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂平板上，用 L形棒涂布于整個表面，注意不要觸及平板邊緣。在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱(30±1) ℃培養1 h，等樣品勻液吸收后翻轉平皿，倒置于培養箱中，(30±1) ℃培養(24±2) h。如果菌落不典型，可繼續培養(24±2) h再觀察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色(表示不發酵甘露醇)，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(表示產卵磷脂酶)。選取適當菌落數平板計數，從每個平板中挑取5個典型菌落，分別劃線接種于營養瓊脂平板做純培養，(30±1) ℃培養(24±2) h，進行確證實驗。

1.3 數學模型的建立

選擇1∶10和1∶100兩個稀釋度中只有一個稀釋度的平板菌落數在20～200 cfu之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落的條件下，建立數學模型：T = Cd/AB 。

式中： T為樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數； A為某一稀釋度蠟樣芽孢桿菌典型菌落的總數(本實驗為1∶10稀釋度)； B為鑒定結果為蠟樣芽孢桿菌的菌落數；C為用于蠟樣芽孢桿菌鑒定的菌落數；d 為稀釋因子(本實驗d=10)。由于本實驗采用添加陽性標準菌株，故B/C為1。

2 結果

2.1 不確定度來源

微生物檢驗中，一般僅對由樣液制備、樣液稀釋、加樣體積引起的不確定度進行分析，對來源于培養基、培養條件、操作人員操作技能等不便計算的不確定度忽略不計。

2.2 樣液制備產生的相對標準不確定度(Um)

2.2.1 天平引入的相對標準不確定度(Um1)

2.2.2 量筒引入的相對標準不確定度(Um2)

2.2.3 樣液制備產生的相對標準不確定度(Um)

Um1和Um2是兩個相對獨立的分量，則Um2=Um12+Um22=0.0122+0.0042=0.01262。

2.3 樣液稀釋產生的不確定度(Uv)

2.3.1 移液器和分度吸量管(移液管)產生的不確定度分量 (Uv1，Uv2)

2.3.2 稀釋產生的不確定度(Uv)

在蠟樣芽孢桿菌檢測過程中，采用100倍稀釋，故稀釋不確定度包括開始的10倍稀釋和后續的10倍系列稀釋。每步稀釋所產生的不確定度Uvx2=(Ux12+Ux22)×bx2/(ax+bx)2。本次由連續稀釋所產生的相對標準不確度Uv2=(Um12+Um22)×2252/(25+225)2+K×(Uv12+Uv22)×92/(1+9)2=(0.0122+0.0042)×0.81+K×(0.0042+0.0022)×0.81=0.01212，Uv=0.0121。K 為≥0的整數，當樣品僅稀釋10倍時，K=0；當樣品稀釋 100倍時，K=1；當樣品稀釋1000倍時，K=2，依次類推。稀釋倍數越多，K值越大，稀釋所產生的不確定度越大。

本次實驗在20 ℃溫度條件下進行，因此可忽略移液器、移液管等溫度與校準時溫度不同而引起的不確定度。若溶液溫度不為20 ℃時，必須考慮溫度對體積的影響。

2.4 加樣體積產生的不確定度(Uj)

2.5 合成不確定度(Uy)

則u(T)=T×Uy =1.43×103×0.0384=2.69。

2.6 檢測結果

本實驗10次檢測結果T分別為1.80×103，1.60×103，1.40×103，1.30×103，1.20×103，1.40×103，1.20×103，1.80×103，1.70×103，1.50×103cfu/g，平均值T為1.49×103cfu/g，則 log T=3.17。

2.7 擴展不確定度

取置信概率p=95%，自由度γ=10-1=9，由t分布表可得k=2.26。故Urel=k×Uy=2.26×0.0384=0.086784≈0.087，則U=Urel×log T≈0.087×3.17≈0.28。

2.8 不確定度報告

當樣品中蠟樣芽孢桿菌平板計數法的檢測結果以平行樣對數值的平均值表示時，其取值區間為3.17±0.28；當檢測結果以平行樣的平均值表示時，相對于對數值的取值再取反對數得其取值區間分布。

3 討論

食品中蠟樣芽孢桿菌的平板計數法實驗步驟復雜，實驗過程中的不確定因素較多，不確定度的來源包括樣液制備、樣液稀釋、加樣體積等，其中對來源于培養基、培養條件、操作人員操作技能等不便計算的不確定度可忽略不計。除了來源于以上介紹的幾種不確定度外，還有來源于樣品的種類、性狀和穩定性、檢測操作的環境、微生物培養條件、菌落計數、培養基、菌落的相互重疊等產生的不確定度，但均可以通過嚴格控制實驗環境、培養條件、提高檢測人員的操作技能，來降低其不確定度來源。

在 CNAS-CL07：2011《測量不確定度評估和報告通用要求》[7]中8.2規定：檢測實驗室應有能力對每一項有數值要求的測量結果進行測量不確定度評估。測量結果不確定度的評定是檢測實驗室質量體系的重要組成部分，而且測量結果不確定度的評定可以使實驗室提供的數據更具有效性、科學性、公正性、可靠性。本文采用的評定方法適用于日常工作中，食品中蠟樣芽孢桿菌平板法計數結果的不確定度評定，其不確定度主要來源于樣品稀釋、加樣和重復檢測等方面。

[1]齊哲,張偉,劉衛華,等.FTA濾膜與環介導等溫擴增技術結合快速檢測消毒乳中的蠟樣芽孢桿菌[J].中國食品學報,2009(3):156-161.

[2]香港食品環境衛生署食品安全中心.食品微生物含量指引[Z].2014:13.

[3]GB 4789.14-2014,食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗[S].

[4]JJC 1036-2008,電子天平[S].

[5]JJG 196-2006,常用玻璃量器[S].

[6]JJG 646-2006,移液器檢定規程[S].

[7]CNAS-GL07：2011,測量不確定度評估和報告通用要求[S].

The Uncertainty Evaluation of Plate Count Method for Bacillus cereus in Food

WU Wei-ling1,2, HU Tong-jing1,2, ZHONG Jun-jie1,2, XU Zhen-dong1

(1.Suzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Suzhou 215104, China;2.Suzhou World Standard Testing Technology Co., Ltd., Suzhou 215104, China)

Objective:To ensure the accuracy of testing results ofBacilluscereusin food. Methods: According to GB 4789.14-2014, the uncertainty of plate count method for detection ofBacilluscereusin food is evaluated. Results: The expanded uncertainty of detection results is 0.28, when the testing result ofBacilluscereusin food by using the plate count method is in parallel to the sample for average value, the value range is 3.17±0.28. Conclusion: The uncertainty evaluation can accurately evaluate the eligibility of food and ensure the safety of food.

food;Bacilluscereus; plate count method; uncertainty

2016-06-22

吳衛玲(1987-)，女，工程師，碩士，研究方向：食品化妝品微生物學。

TS201.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.027

1000-9973(2016)12-0118-04