孕烯醇酮衍生物體外抗癌活性研究*

耿曉宇，于春影，王艷秋

(1.通化師范學院制藥與食品科學學院，吉林通化134002;2.江蘇豪森藥業股份有限公司，江蘇連云港224200; 3.通化市衛生學校，吉林通化134002)

孕烯醇酮衍生物體外抗癌活性研究*

耿曉宇1，于春影2，王艷秋3

(1.通化師范學院制藥與食品科學學院，吉林通化134002;2.江蘇豪森藥業股份有限公司，江蘇連云港224200; 3.通化市衛生學校，吉林通化134002)

目的:研究孕烯醇酮衍生物的體外抗癌活性.方法:采用MTT活細胞染色法，對3個孕烯醇酮衍生物進行了PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞體外增殖抑制實驗.結果:3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2)具有較好的抗癌活性.結論:孕烯醇酮衍生物的抗癌活性值得進一步研究.

3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯;3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸;孕烯醇酮衍生物;抗癌活性;MTT法

1 引言

2008年劉躍金等［1］報道了3β，5α，6β－三羥基膽－24－酸甲酯、膽甾－3β，5α，6β－三醇對小鼠肉瘤S180有一定的體內抗癌活性.2011年，Carvalho JFS等［2］進行了HT－29等7個瘤株的體外抗癌活性篩選，表明3β，5α－二羥基膽甾－6－肟、6β－甲氧基膽甾－3β，5α－二醇、膽甾－3β，4 β，5α，6β－四醇和6β－乙酰氧基膽甾－3β，5α－二醇均具有較好的體外抗癌活性.2013年Wang P等［3］在中國南海從柳珊瑚Menella kanisa中分離得到麥角甾 －3β，5α，6β－三醇、膽甾 －3β，5α，6β－三醇等27個甾體化合物，對人肺癌A549細胞具有不同的抗癌活性.同年，Liu TF等［4］在中國南海從柳珊瑚中分離得到膽甾－1β，3β，5α，6β－四醇，對A549和MG－63表現出較好的抗癌活性，并能誘導A549細胞凋亡.2016年，張楊梅［5］等在中國南海紅樹林底泥的海洋鏈霉菌 H41 －59發酵物中的次級代謝產物中分離得到10個甾醇類化合物，發現麥角甾－8(9)，22－二烯－3β，5α，6β，7α－四醇、麥角甾－8(14)，22－二烯－3β，5α，6β，7α －四醇對人肺癌細胞 NCIH460、人乳腺癌細胞MCF－7和人神經膠質瘤細胞SF－268具有較好的抑制活性.

PC－12細胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的細胞系，主要分泌產物為兒茶酚胺類遞質，因其具有可傳代培養的特點，廣泛用于神經生理、病理及藥理方面研究，有助于闡明神經系統疾病的發病機制、藥物療效，探索新的藥物與治療手段［6］.

本文研究了3個孕烯醇酮衍生物對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的生長影響，進行了體外抗癌活性篩選，以期獲得較好活性的甾體化合物.

2 材料與儀器

孕烯醇酮衍生物:3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2)和3β，5α，6β－三羥基孕甾－20－酮(A3)含量皆為質量分數≥99%(沈陽化工大學制藥與生物工程學院提供);RPMI1640培養基(美國Gibco公司);四季青小牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);其他試劑，分析純(天津市博迪化工有限公司);PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(中國科學院上海生科院細胞資源中心).

北京普郎DNM－9602G酶標儀，北京儀和方圓科技有限公司;INC02－108 CO2培養箱，德國Memmert公司等.

圖1 孕烯醇酮衍生物的結構式

3 實驗方法

PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞MTT活細胞染色法體外增殖抑制實驗取生長狀態良好的PC －12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，接種于含質量濃度為10%小牛血清培養液，配制成單個細胞懸液，接種于96孔板，每孔5～50個懸浮細胞·L－1，體積200μL.置37℃、CO2為體積分數5%培養箱培養約4d.每孔加5mg·L－1MTT 150μL，搖床振蕩15min以充分溶解結晶物.在570nm用酶標儀測定各孔吸光度.

收集處于對數增長期的PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，然后用質量濃度25%的胰酶消化，再以RPMI1640培養液稀釋至1×106個懸浮細胞·L－1.在96孔培養板每孔接種100μL，置培養箱內調溫度至37℃、CO2為體積分數5%，培養24h.棄培養液，以磷酸鹽緩沖液洗兩次.樣品精密稱定，以二甲基亞砜助溶，加磷酸鹽緩沖液稀釋，每孔加入的終濃度為 0.012、0.024、0.048、0.096、0.192、0.384mmol·L－1培養20h.每孔加5mg·L－1MTT 20μL繼續培養4h后，棄培養液，每孔加入二甲基亞砜150μL，振蕩15min.在570nm用酶標儀測定各孔吸光度.抑制率=(1－加藥組吸光度值/對照組吸光度值)*100%，采用數據處理軟件SPSS 19.0計算IC50值.

4 實驗結果

(1)以濃度(x，mmol·L－1)為橫坐標，細胞抑制率(%)為縱坐標，繪制三種物質的濃度——細胞抑制率曲線如圖2－4所示.

圖2 3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1) 對PC－12細胞抑制率曲線

圖3 3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2) 對PC－12細胞抑制率曲線

圖4 3β，5α，6β－三羥基孕甾－20－酮(A3) 對PC－12細胞抑制率曲線

(2)IC50值

表1 化合物A1－A3對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞體外IC50值

4 討論與結論

目前，惡性腫瘤的治療方法仍然是以手術、化療、放療為主的綜合治療.臨床常用的化療藥物主要是通過細胞毒作用殺傷腫瘤細胞，但由于大多數化療藥物毒性大，許多患者難以承受［7］.需要研制新抗腫瘤藥以提高療效，降低毒副作用，提升病人的生活質量.近年來發現很多甾體化合物具有抗腫瘤活性，而且毒副作用小.

半數抑制濃度(IC 50)是指在用藥后存活的細胞數量減少一半時所需的藥物濃度，是標志藥物效應的一種重要定量指標.本實驗用MTT活細胞染色法研究了不同濃度的3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2)、3β，5α，6β－三羥基孕甾－20－酮(A3)對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞的生長影響.3種藥物IC50值分別為0.0814mmol·L－1、0.0977mmol·L－1、0.2132mmol·L－1，對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞都有一定抑制作用.

3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羥基雄甾－17β－羧酸(A2)、 3β，5α，6β－三羥基孕甾－20－酮(A3)對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞體外活性研究未見報道.本實驗研究發現(A1)、(A2)對PC－12大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤的活性較好，值得進一步進行藥效學、毒理、作用機制等研究.另外，孕烯醇酮衍生物與現有的抗癌藥物聯合使用增加治療效果也是下一步所追求的目標.

［1］劉躍金，耿曉宇，王晶明，等.羥基膽烷酸類和羥基膽甾烷類化合物的體內抗癌活性［J］.中國現代應用藥學，2008，25(7):601－604.

［2］CARVALHO JFS，SILVA MMC，MOREIRA JN，et al.Selective cytotoxicity of oxysterols through structural modulation on rings A and B.synthesis，in vitro evaluation，and SAR［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2011，54(18):6375－6393.

［3］WANG P，TANG H，LIU BS，et al.Tumor cell growth inhibitory activity and structure activity relationship of polyoxygenated steroids from the gorgonian Menella kanisa［J］.Steroids，2013，78(9):951－958.

［4］LIU TF，LU X，TANG H，et al.3β，5α，6β－Oxygenated sterols from the South China Sea gorgonian Muriceopsis flavida and their tumor cell growth inhibitory activity and apoptosis－inducing function ［J］.Steroids，2013，78(1):108－114.

［5］張楊梅，李先盛，李紅玉，等.海洋鏈霉菌H41－59甾醇類化學成分及其細胞毒活性研究［J］.天然產物研究與開發，2016，28 (5):690－695.

［6］Mouri K，Sako Y.Optimality conditions for cell－fate heterogeneity that maximize the effects of growth factors in PC12 cells［J］.PLoS Comput Biol，2013，9(11):e1003320.

［7］Zhang HT，Luo H，Wu J，et al.Galangin induces apoptosis of hepatocellular carcinoma cells via the mitochondrial pathw ay［J］.World J Gastroenterol，2010，16:3377－3384.

(責任編輯:王海波)

O626.21

A

1008－7974(2016)06－0058－03

10.13877/j.cnki.cn22－1284.2016.12.018

2016－10－25

耿曉宇，遼寧莊河人，碩士研究生，助教.