小麥幼胚離體培養再生體系的建立

王宇宏,張 彬,王玉國

（1.山西省生物研究所，山西太原030031；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

小麥幼胚離體培養再生體系的建立

王宇宏1,張 彬2,王玉國2

（1.山西省生物研究所，山西太原030031；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

選擇不同小麥品種的幼胚作為試驗材料，對影響其愈傷組織誘導及植株再生的因素進行分析。結果表明，小麥幼胚組培最適胚齡為12～14 d；在最適胚齡下，基因型對胚性愈傷組織的發生頻率影響較大，對小麥幼胚培養出愈率的影響并不顯著。在加有2，4-D 1mg/L＋KT 0.5mg/L的基本培養基中進行繼代培養，晉農232、晉農318和晉農234胚性愈傷組織的誘導率最高，分別達74.6%，70.3%和60.8%。此外，培養基中添加一定量的含氮有機物，也可提高胚性愈傷組織的誘導率，即晉農232添加300 mg/L Gln，晉農318添加500 mg/L Gln＋300 mg/L CH后，其胚性愈傷組織的誘導率均有顯著提高。分化培養中，添加ZT 3mg/L和NAA 1mg/L對晉農232、晉農318和晉農234等3個品種愈傷組織誘導分化的效果最好，其再分化率分別達到72.5%，57.5%和62.5%。生根培養中添加IAA 0.8mg/L的1/2基本培養基可以誘導芽快速生壯根。

小麥；幼胚；愈傷組織；植株再生

小麥（Triticum aestivum L.）屬禾本科（Gramineae）麥屬（Tritium），是重要的糧食作物之一，是世界上種植面積最廣、總產量最高的作物[1]。生物技術的興起與發展，為改良小麥品種資源提供了新的有效方法。植物組織培養技術為小麥無性系的利用及小麥遺傳轉化體系的建立提供了技術支持。目前，小麥的離體再生是一項國際難題，只有少數實驗室獲得了小麥遺傳轉化體系，這阻礙了小麥基因工程方面的進一步研究。優化小麥組織培養條件，提高植株再生效率是小麥生物技術育種亟待解決的重要課題。小麥幼胚愈傷組織分化能力較其他組織器官高，是進行小麥基因轉化的良好受體[2-4]。

本研究以原產于山西省的6個小麥栽培種（晉農232、晉農234、農大189、晉麥48、晉農318、小麥207）作為試驗材料，系統研究了影響小麥幼胚愈傷組織誘導及植株再生的因素，旨在探索建立一套合適的植株再生體系最有效的方法。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本試驗選用了原產于山西省的6個小麥栽培種作為試驗材料，其中，晉麥48與農大189由山西農業大學栽培實驗室提供，小麥207、晉農232、晉農234與晉農318由山西農業大學遺傳育種實驗室提供。

1.2 培養基

1.2.1 基本培養基 MSB＋3%蔗糖＋6%瓊脂粉，pH值調至5.8。

1.2.2 愈傷組織的誘導培養基 基本培養基＋2，4-D 2mg/L。

1.2.3 繼代培養基 （1）基本培養基＋2，4-D 1 mg/L＋KT 0.5 mg/L；（2）基本培養基＋2，4-D 1 mg/L＋ABA 0.5 mg/L；（3）基本培養基＋2，4-D 1 mg/L；（4）基本培養基＋2，4-D 2 mg/L＋ABA 0.5 mg/L；（5）基本培養基＋2，4-D 6mg/L。

1.2.4 分化培養基 基本培養基＋ZT/NAA不同濃度配比（1∶0.5，2∶0.5，2∶1，3∶1，3∶1.5）激素組合或BA/NAA不同濃度配比（1∶0.5，2∶0.5，3∶0.5，1∶1，2∶1，3∶1）激素組合。

1.2.5 生根培養基 1/2 MS培養基（其余的同基本培養基）＋不同濃度的IAA和IBA。

1.3 試驗方法

1.3.1 無菌外植體的制備 選擇生長發育正常且具有代表性的小麥植株作為試驗材料，在其開花前進行掛牌標記，并實時觀察胚的發育情況。開花10d起隔日取樣，剝去籽粒內外穎殼，將去殼后的未成熟種子在無菌條件下先用75%的乙醇溶液消毒30 s，使用無菌水漂洗3～4次后用0.1%的氯化汞溶液消毒15min，再用無菌水重復漂洗3～4次。小心地剝出幼胚作為外植體，此操作要嚴格按照要求在超凈工作臺中完成。

1.3.2 愈傷組織的誘導 在超凈工作臺中將幼胚盾片向上接種于誘導培養基上，每個培養皿接種20枚，封口膜封口，置于室溫為（23±1）℃的培養室內進行暗培養。30d后對愈傷組織的出愈率及胚性愈傷組織的誘導率進行統計記錄，觀察胚性愈傷組織的大小、顏色與質地。具體的統計標準為：胚性愈傷組織表現出表面淡黃、凹凸不平、致密不透明；非胚性愈傷組織表現出表面發白，質地松散。通過比較小麥幼胚胚齡和基因型對幼胚培養出愈率及體細胞胚性無性系產生的影響，篩選出小麥幼胚培養的最佳時期。

愈傷組織出愈率＝產生的愈傷組織數/接入的幼胚數×100%；胚性愈傷組織誘導率＝胚性愈傷組織數/產生的愈傷組織總數×100%。

1.3.3 繼代培養 將誘導獲得的愈傷組織接種于含有不同濃度的2，4-D或者另配有不同濃度的ABA，KT的繼代培養基上（1.2.3中的（1）～（5）），在室溫（23±1）℃下進行暗培養，每隔7d繼代培養一次。培養過程中實時觀察愈傷組織的色澤、大小和質地；準確記錄胚性愈傷組織誘導情況并統計其誘導率，以此為依據，篩選出最適繼代培養的激素濃度配比，并在此基礎上，添加不同濃度的谷氨酰胺（Gln）、水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH），觀察這3種有機物對體細胞無性系產生的影響。

1.3.4 分化培養 將繼代培養中產生的胚性愈傷組織接種到含有不同激素配比的分化培養基上，在光強2500lx，光照16h/d，室溫26℃的條件下進行分化培養。期間每隔5～7d繼代培養一次，觀察記錄胚性愈傷組織形態變化的特征和時間并計算分化率。

分化率＝產生綠色原基的愈傷組織數/接入的愈傷組織數×100%。

1.3.5 生根培養 將分化培養產生的綠芽及其分蘗接種于生根培養基中，在光強2500lx，室溫26℃的條件下進行培養。在1/2 MS生根培養基中添加IAA和IBA這2種生長素，觀察比較培養基對誘導生根的影響。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導

2.1.1 胚齡對小麥幼胚組織培養的影響 自小麥開花后10d起，隔日取樣。將脫去外穎殼后的未成熟種子進行消毒，在無菌條件下剝出幼胚并接種于誘導培養基上，30 d后記錄統計愈傷組織誘導率、胚性愈傷組織誘導率和幼胚直接萌發率。

3個小麥品種不同胚齡的幼胚組織培養后的統計結果列于表1。每個品種的出愈率和胚性愈傷誘導率的大小均與胚齡相關。以晉農318為例，胚齡為10～18 d的幼胚出愈率均達到90%以上，隨幼胚胚齡的升高出愈率也逐漸升高，在第18天時達到100%；幼胚在胚齡為14，12 d時，胚性愈傷組織形成量顯著多于其他胚齡，其胚性愈傷誘導率分別為60.53%和57.85%，而18 d時，胚性愈傷誘導率僅為35%。在培養過程中，對不同品種不同胚齡的小麥幼胚的直接萌發情況進行統計，結果表明，隨著胚齡的增加幼胚的直接萌發率呈現上升趨勢，胚齡為10 d時，3個品種均未出現萌發現象，晉麥48在整個幼胚培養的過程中直接萌發率較其他2個品種高。綜合比較發現，在直接萌發率較高的胚齡下，產生的胚性愈傷組織較少，胚性愈傷組織的誘導率較低。綜合分析胚齡與出愈率、胚性愈傷組織誘導率及直接萌發率的相關性，認為最適宜小麥幼胚組織培養的胚齡為12～14d。

表1 胚齡對小麥幼胚培養特性的影響

2.1.2 基因型對小麥幼胚組織培養的影響 對處于適宜胚齡（12～14 d）的6個小麥品種（系）進行取樣、培養，比較各品種幼胚的出愈率和胚性愈傷誘導率，分析基因型對小麥幼胚組織培養的影響（表2）。在最適胚齡條件下，6個小麥品種的幼胚出愈率在92.67%～100%，變異幅度小，因此，供試小麥基因型對其幼胚出愈率的影響并不顯著。此外，不同小麥品種幼胚胚性愈傷組織的誘導率存在一定差異，其中，晉農232的誘導率最高，達到64.77%，農大189的誘導率最低，僅為18.79%，二者差異顯著，由此可見，基因型對胚性愈傷組織的發生頻率有影響。

表2 基因型對小麥幼胚培養特性的影響

2.2 繼代培養

2.2.1 植物激素對小麥幼胚胚性愈傷組織誘導的影響 為了研究2，4-D，ABA，KT等植物激素種類及濃度對胚性愈傷組織誘導的影響，本試驗以晉農232、晉農318、晉農234等3個小麥品種的幼胚誘導15 d所得的愈傷組織為材料進行不同的繼代處理，結果如表3所示。在培養基中加入1 mg/L的2，4-D和0.5 mg/L的KT后，3個小麥品種的胚性愈傷組織誘導率均明顯高于其他處理，并產生顏色淡黃，表面多瘤狀突起的愈傷組織，即典型的胚性愈傷組織。僅在培養基中添加2，4-D，愈傷組織的生長速度隨2，4-D濃度的增加而加快，但胚性愈傷組織誘導率呈現下降趨勢，由表3可知，當2，4-D為6 mg/L時，3個小麥品種的胚性愈傷組織誘導率均在15%以下，產生的愈傷組織質量明顯下降，顏色發白、水漬狀嚴重。

表3 不同植物激素對小麥胚性愈傷組織誘導的影響

2.2.2 不同有機物添加配方對小麥幼胚胚性愈傷組織誘導的影響 本試驗以晉農232和晉農318這2個小麥品種的幼胚誘導15 d所得的愈傷組織為供試材料，在誘導培養基上添加相應濃度配比的有機物（Gln，CH，LH）配方如表4所示。

表4 添加不同有機物配方 mg/L

由圖1可知，在誘導培養基上添加一定量的有機物配方后，晉農318幼胚的胚性愈傷組織的誘導率較未添加時高。在僅添加300 mg/L或500 mg/L的Gln，CH或LH的培養基中，小麥幼胚胚性愈傷組織的誘導率并無明顯差異，但添加CH產生的作用效果略優于LH，Gln的作用相對較弱。同時添加Gln和CH或LH與單獨添加其中一種有機物對胚性愈傷組織的誘導效果無明顯差異。在加有500mg/L的Gln和300 mg/L的CH的培養基中培養出的胚性愈傷組織誘導率最高。對于晉農232，單獨添加300 mg/L的3種有機物對提高胚性愈傷組織誘導率均有一定效果，其中，CH的作用效果更明顯。

2.3 分化培養

將上一階段由繼代培養基（1）中誘導產生的胚性愈傷組織分別培養于含有不同激素配比的分化培養基中，比較幼胚愈傷組織分化情況。分化培養期間觀察發現，在胚性愈傷組織上首先形成了綠色葉狀體，隨后由葉狀體的基部生成多個綠芽。分化培養35～40d后記錄，統計分化率。

2.3.1 不同濃度ZT與NAA配比對小麥幼胚愈傷組織分化的影響 由表5可知：（1）在ZT/NAA的配比為2∶1和3∶1時，最有利于小麥幼胚愈傷組織的分化，分化率均達到50%以上。以晉農232為例，當NAA為0.5 mg/L，ZT分別為1，2 mg/L時，晉農232幼胚愈傷組織的分化率分別為15%和45%，NAA為1 mg/L時晉農232的分化率分別達到了67.5%和72.5%。不同濃度配比的NAA和ZT對晉農318和晉農234這2個小麥品種幼胚愈傷組織分化的影響也有相同的趨勢。當ZT達到3 mg/L同時NAA增大到1.5mg/L時，3個小麥品種幼胚的分化率均急劇下降，均低于15%。（2）增加ZT濃度有利于愈傷組織的分化。當ZT為3 mg/L，NAA為1 mg/L時，晉農232、晉農318及晉農234幼胚愈傷組織的分化率分別為72.5%，57.5%和62.5%，均較其他配比組合要高。但當增加NAA濃度時，3個品種的分化率均呈現下降趨勢。由此可見，ZT和NAA濃度配比為3∶1時最適宜以上3個小麥品種幼胚愈傷組織的分化。在最適激素配比下品種間也存在差異，其中以晉農232的分化率最高。

表5 不同ZT/NAA濃度配比對小麥愈傷組織分化的影響

2.3.2 不同濃度BA與NAA配比對小麥幼胚愈傷組織分化的影響 從表6可以看出，在BA和NAA配比中，當BA濃度不變時，提高NAA濃度會抑制愈傷組織的分化。例如，當BA為2 mg/L時，NAA由0.5 mg/L升高到1 mg/L時，3個品種愈傷組織分化率分別由50%降低到22.5%（晉農232），40%降低到10%（晉農318），47.5%降低到17.5%（晉農234）。此外，從表6還可以看出，BA和NAA濃度配比為2∶0.5時，3個品種的幼胚愈傷組織分化率最高，即該濃度配比最適合晉農232、晉農318和晉農234愈傷組織的分化。

表6 不同濃度NAA與BA配比對小麥愈傷組織分化的影響

綜合比較上述2種激素組合（ZT/NAA和BA/ NAA）在各自最適濃度配比下3個品種幼胚愈傷組織的分化情況，只有在同時添加了1 mg/L NAA和3 mg/L ZT后的培養基中培養的3個品種幼胚愈傷組織分化率同時超過50%，晉農232為72.5%，晉農318為57.5%，晉農234為62.5%，因此，以上激素組合配比最佳。在最適激素濃度配比下，以晉農232的分化率最高。

高中物理課堂教學方式方法革新，是應新課標為己任的新式教學方法，也是以互動學習和基礎學習為目標的學科系統化教學.高中物理知識點如力和運動的關系、動能概念、 電磁感應、核能等教學內容，需要教學方式上進行創新，才能最大程度實現高中課堂教學效果最大化.為順應新式教學理念，倡導物理教學方式方法革新，應用合作學習具體教學策略，最終實現學生教學理性變化，注重合作學習方法的合理應用.

2.4 生根培養

本試驗以晉農232為供試材料。將其幼胚愈傷組織表面綠芽及其分蘗接種于不同的生根培養基上，在培養過程中，綠芽逐漸伸長并同時產生大量的小根。

由圖2可知，在含有0.8 mg/L IAA的生根培養基中，生根率最高，達到83%。生根培養過程中觀察到，此培養基能促進芽快速生根，根系叢生，根系發達，主根粗長健壯，須根多且盤曲；當生根培養基中含0.2 mg/L IAA或1.2 mg/L IAA時，誘導產生的根較少，只有少數短而粗的主根，且生長緩慢。在添加了IBA的生根培養基中，當IBA濃度為0.4mg/L時，芽快速誘導生根，生根率達78%以上，產生的主根多且長，并產生粗長盤曲的少量須根。綜上所述，IAA更有利于小麥試管苗生根，最適濃度為0.8 mg/L，其次為IBA，有效濃度為0.4mg/L。

3 結論與討論

3.1 胚齡對小麥幼胚組織培養的影響

在小麥幼胚組織培養的過程中，外植體幼胚的發育程度在相當大的程度上決定了培養工作的成敗和培養效果的好壞。研究者習慣用幼胚“直徑大小”[5]或“授粉后胚發育的天數”[6]來表示幼胚的胚齡，其中，“授粉后胚發育的天數”更為客觀，應用更廣。目前關于小麥幼胚組織培養最適胚齡的研究由于受到品種、栽培條件等因素的限制并無統一結論，王常云等[6]研究認為，煙臺地區小麥幼胚培養的有效胚齡為14～20 d，最適胚齡為16 d，與栗現芳等[7]對雜交小麥西雜一號、西雜五號及其親本的研究結果相同。宋運賢等[8]研究發現，宿9908及皖麥53的最適胚齡為14d。而關于胚齡在幼胚組織培養中的作用有學者認為，胚齡影響了愈傷組織發生的起始部位和強度[9]，也有人認為，胚齡影響了愈傷組織的分化率，對幼胚愈傷組織的誘導率并無影響[6]。本試驗中選用的3個小麥品種晉農318、晉農232和晉麥48種植于山西省晉中地區，因此，本研究初步認為晉中地區小麥幼胚組織培養的最適胚齡為12～14d。

3.2 基因型對小麥幼胚組織培養的影響

植物基因型作為內因顯著影響了植物離體培養過程中胚性愈傷組織和體細胞胚的發生。曾寒冰等[10-13]研究認為，在小麥幼胚培養過程中，誘導愈傷組織及誘導分化上的差異取決于品種的遺傳特性。于曉紅等[14]研究發現，基因型只影響到愈傷組織的分化率。由此可見，基因型與愈傷組織的分化存在相關性已達成一定的共識，但對于基因型是否影響愈傷組織的出愈率仍無定論。外植體培養過程中，產生了胚性和非胚性2種類型的愈傷組織。小麥的再生植株發生都經過了愈傷組織階段，有再生能力的胚性愈傷組織在所有愈傷組織中的比例大小直接關系到基因型對分化率的影響，因此，基因型是通過影響胚性發生率來影響再生植株的分化率。

本試驗從小麥幼胚愈傷組織出愈率和胚性愈傷誘導率2個方面對基因型所產生的作用進行了分析。結果表明，基因型對胚性愈傷組織誘導率產生了顯著影響，而出愈率與基因型并無顯著相關性。在最適的胚齡期內對供試的6個品種進行取樣、培養，在同一培養基上愈傷組織的誘導率均達到90%以上，但胚性愈傷組織誘導率之間的差異卻很明顯，晉農232最高，達到64.77%，農大189最低，只有18.75%。

3.3 激素對小麥幼胚組織培養的影響

本試驗結果表明，在誘導培養基中添加2 mg/L的2，4-D最佳，而在繼代培養基中則是以1 mg/L效果較好。此外，對于另一些激素的作用也有相關的報道，Nabors等[20]在小麥未成熟胚培養試驗中，發現細胞分裂素可以顯著促進一些品種的胚發生，在含生長素的培養基上添加KT可提高胚性愈傷組織的形成和胚狀體的發生。本試驗也得出了類似的結果，研究表明，KT顯著提高了小麥幼胚胚性愈傷組織誘導率，最適宜濃度為0.5mg/L。

小麥愈傷組織在光照條件下，在分化培養基中先后分化產生分化原基、芽或不定根。不定根和芽的分化順序將影響植株的再生，只有先分化形成芽，愈傷組織在生根培養基上進一步長出根，才能形成完整的再生植株。因此，有效地誘導芽分化是提高植株再生率的一個重要環節。植物激素在植物組織培養器官或胚狀體的分化過程中起到了重要的調節作用。不同作物品種對外源激素的敏感性不同。適宜濃度配比的細胞分裂素和生長素可以有效地控制胚性愈傷組織的分化，形成苗和根，最終獲得再生植株。本研究結果表明，針對供試的3個小麥品種，添加一定比例的激素組合ZT/NAA較BA/NAA這一組合對提高幼胚愈傷組織分化率的效果更明顯。在生根培養基中添加0.8mg/L IAA和0.4mg/L IBA能誘導芽快速生根，根系健壯。IAA對生根率的作用效果要優于IBA。

4 結論

小麥幼胚愈傷組織誘導過程中，選擇胚齡為12～14 d幼胚，胚性愈傷組織誘導率最高；在最佳胚齡條件下，不同基因型小麥的胚性愈傷組織的發生頻率不同，因此，誘導率之間也存在較大差異，晉農232和晉農318效果最好，胚性愈傷組織誘導率分別達到64.77%，62.67%。

在小麥幼胚愈傷組織繼代培養過程中，在附加了1 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L KT激素組合的培養基中培養的晉農232、晉農318、晉農234等3個小麥品種的胚性愈傷組織的誘導率分別達到74.6%，70.3%和60.8%，明顯高于其他處理，此外，含氮有機物的添加也可促進胚性愈傷組織的誘導，添加300 mg/L Gln對晉農232以及添加500 mg/L Gln＋300 mg/L CH對晉農318胚性愈傷組織誘導率的提高均起到了促進作用。

在小麥幼胚愈傷組織分化培養過程中，NAA 1 mg/L＋ZT 3 mg/L是培養基中添加的最理想激素配比。在此條件下，晉農232、晉農234、晉農318等3個小麥品種愈傷組織分化率均較高，分別達到72.5%，62.5%和57.5%。

小麥幼胚離體培養后期，添加0.8 mg/L IAA和0.4 mg/L IBA，可以誘導芽快速生根，且根系健壯，0.8mg/L的IAA的生根效果最佳。

由生根試驗結果可知，在無激素的基本培養基上或添加了IAA，NAA，IBA的培養基上，小麥試管苗均能誘導生根，但生根率及根系生長狀況存在一定差異。

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Establishment of Regeneration System of W heat Immature Embryos Culture in vitro

WANG Yuhong1，ZHANG Bin2，WANG Yuguo2
（1.Biology Institute ofShanxi，Taiyuan 030031，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The paper studied wheatimmature embryoswith six cultivars in vitro and the factors of wheatcallus induction and plant regeneration.The resultshowed that the age of immature embryos for its tissue culturewas14-16 d.Among the optimum ageof immature embryos,genotype had little effects on callus induction of immature embryos while it had remarkable effect on the induction frequency of embryogenic callu.Jinnong232 and Jinnong 318 had relatively good culturing characters.The optimum subculturemedium was the basal medium supplementedwith 2,4-D（1mg/L）and KT（0.5mg/L）.In thismedium,the induction frequency ofembryogenic callusof Jinnong 232,Jinnong 318 and Jinnong 234 could reach 74.6%,70.3%,60.8%.The optimum hormone concentration added to basal medium for callus differentitation was NAA 1 mg/L and ZT 3 mg/L with a callus differentiation frequency more than 50%.The root formation could be stimulated by halfamountofbasal medium togetherwith 0.8mg/L IAA.

wheat;immature embryos;callus;plant regeneration

Q813.1；S512.1

A

1002-2481（2016）07-0900-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.03

2016-02-29

王宇宏（1979-），女，山西懷仁人，助理研究員，碩士，主要從事農學及土壤生態學研究工作。王玉國為通信作者。