HIF-1反義核酸對金魚HIF-1α及其靶基因VEGF表達水平的影響

郭曉萍，周旖旎，曹詣斌

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

HIF-1反義核酸對金魚HIF-1α及其靶基因VEGF表達水平的影響

郭曉萍，周旖旎，曹詣斌

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

金魚是低氧耐受能力最強的淡水魚類之一，低氧誘導因子-1（hypoxiainducedfactor，HIF-1）在動物低氧應答調節中發揮關鍵作用，目前尚沒有關于魚類HIF-1抑制劑的研究報道。試驗分析了HIF-1反義寡聚核苷酸對金魚肝臟組織HIF-1及其靶基因血管內皮生長因子（vascularendothelial growthfactor，VEGF）的基因表達差異。熒光定量PCR結果顯示，低氧狀態下，30，60mg/kg劑量的反義核酸能有效抑制VEGF基因的表達，但對HIF-1α mRNA水平沒有影響。制備金魚HIF-1兔源多克隆抗體并進行WesternBlot分析，結果顯示，60 mg/kg劑量的反義核酸抑制低氧所誘導的HIF-1蛋白水平的上升，表明合成的反義核酸能夠特異性地抑制金魚HIF-1 mRNA的翻譯。金魚HIF-1抗體的合成及反義寡聚核苷酸的制備，可為進一步探索金魚獨特的低氧應答機制提供有效研究手段。

HIF-1；反義核酸；低氧；金魚

低氧誘導因子1（Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是低氧信號調控的重要轉錄因子，由一個α亞基和一個β亞基組成[1]。HIF-1的氧敏感調控主要發生在HIF-1α亞基。常氧狀態下，HIF-1α在相關功能域的作用下降解。低氧條件下，降解途徑被中斷，HIF-1α的穩定性提高并積累。激活后的HIF-1在其他轉錄因子的共同作用下，與靶基因的低氧應答元件相結合并調控其表達，如葡萄糖代謝途徑的己糖激酶（HK）和乳酸脫氫酶（LDH），血管生成相關的血管內皮生長因子（Vascular endothelial growthfactor，VEGF）等[2]。VEGF是血管生成的主要調節因子，特異性地作用于血管內皮細胞，促進細胞的有絲分裂，使毛細血管的通透性增加。目前研究發現，腫瘤的生長、浸潤和轉移都與新生血管形成有關[3]。

人們對HIF-1小分子抑制劑進行了多方面的研發，如影響HIF-1α蛋白合成和降解、HIF-1α和HIF-1β二聚化作用、HIF-1α和DNA的結合等[4]。但是，目前還未獲得成功上市的特異性HIF-1抑制劑。反義寡聚脫氧核酸（antisense oligonucleotide，反義DNA）是一種短序列單鏈DNA片段，它與目標mRNA的一個或多個位點互補，從而減少或抑制由該基因所編碼多肽的合成[5]。反義DNA可以在mRNA的剪接、轉錄和翻譯水平抑制基因的表達[6]。反義DNA特異性較強，作用迅速，具有局部抑制特性和可逆性，在試驗動物模型建立中比較經濟、方便且毒副作用較低[7-8]。

金魚（Carassius auratus）作為鯽魚的變種，是低氧耐受能力最強的淡水魚類之一，可能是迄今唯一一種能在室內不依賴氣泵而長期生存的魚類。金魚擁有一系列獨特的低氧適應生理機制，但相關機制的分子調控機理及其與HIF-1之間的關系尚不明確。本研究擬通過金魚HIF-1反義寡聚核苷酸抑制劑和多克隆抗體的制備，為金魚耐低氧分子機制的研究提供有效分析方法。

1 材料和方法

1.1 材料

金魚體質量10～15 g，購于金華市花鳥市場。實驗室魚缸中馴化4～5 d，以商品化魚食喂養，馴化養殖期間均活動正常，無病，試驗前1 d停止投餌。

1.2 試驗藥物與條件

根據金魚HIF-1α序列，硫代反義寡聚核苷酸序列為AAAGCCTCAAGTGTCCCAT[9]，由賽百勝公司合成。注射前用魚類生理鹽水（A液：1mol/L NaCl，0.03 mol/L KCl，0.01 mol/L MgSO4·7H2O，0.1 mol/L KH2PO4；B液：0.025 mol/L CaCl2；C液：0.25 mol/L NaHCO3。使用時，每100mL蒸餾水中各加入10mL A液、B液和C液）將反義核酸稀釋，常氧生理鹽水組與低氧生理鹽水組各注射200 μL生理鹽水，試驗組分別注射30，60 mg/kg劑量的反義寡聚核苷酸。藥物注射后常氧狀態下培養12 h。

1.3 低氧處理

選擇身體健康、反應靈敏、大小基本一致的金魚，隨機取魚分組，分為常氧生理鹽水組、低氧生理鹽水組、低氧反義核酸組，每組4只。試劑注射前，統一以1.5 g/L的MS222水溶液進行麻醉處理。待輕觸其頭部反應遲鈍時，迅速抓取，采用腹腔注射法，分別給對照組注射生理鹽水溶液，試驗組注射反義核酸溶液。注射完成后，將魚體放回正常生長的自來水中，使其自行蘇醒。12 h后，試驗組進行低氧處理。在低氧處理過程中，持續充入氮氣使氧濃度水平保持為2 mg/L，采用溶氧儀（DISSOLVED OXYGEN METER AZ8403）檢測氧含量。在低氧處理6 h后，取出魚體，于MS222水溶液中麻醉后，解剖提取肝臟組織并迅速放入液氮后，轉入-80℃冰箱保存備用。

1.4 Real Time PCR

將肝臟組織從-80℃超低溫冰箱取出，用Trizol法提取肝組織樣品的總RNA，進行RT-PCR。參照TOYOBO公司ReverTra AceqPCR RT Kit說明操作，將總RNA反轉錄成cDNA，用于Real Time PCR（RT-PCR）。

Real Time PCR用 Thunderbird SYBRRqPCR Mix試劑盒（Toyobo）和ABI Stepone plus熒光定量PCR儀進行qPCR分析，檢測HIF-1α及其靶基因VEGF基因表達水平差異。擴增反應總體系為20μL，其中包括：SYBR GREENⅡ，10 μL；cDNA，2 μL；引物F/R，各0.4 μL；ROX，0.4 μL；ddH2O，6.8 μL。反應條件：98℃，10min；98℃，30 s；55℃，45 s。40個循環后，進行溶解曲線反應，條件98℃，30 s；55℃，45 s。采用ΔΔCt法分析數據。

1.5 Western Blot檢測

以金魚 HIF-1α 759～774位氨基酸序列（CHLLQGEELLRALDQVN）合成多肽作為抗原，免疫兔子4次10周。分離血清，間接ELISA檢測抗體效價達到1∶60 000以上，特異性多肽親和純化，Western Blot檢測抗體特異性。

從-80℃超低溫冰箱取出金魚肝臟組織，放入加有300μL RIPA與5 μL PMSF的EP管內，用組織細胞破碎儀破碎3次，每次10 s，至液體澄清，再向EP管內加入200 μL RIPA，12 000×g，4℃，離心10min。取上清30 μL，加入7.5μL 5×SDS上樣緩沖液，99℃，10 min變性。變性后的樣品進行Western Blot檢測。12%SDSPAGE電泳，轉移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉90 min，4℃一抗孵育過夜，37℃孵育辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗兔2 h，最后以ECL顯色法（碧云天，特超敏ECL化學發光試劑盒）進行顯色成像（Tanon6600成像儀）。

1.6 統計學分析

試驗重復4次，數據采用Excel軟件統計和做圖，組間差異采用t檢驗進行比較。

2 結果與分析

2.1 HIF-1α及其靶基因VEGF熒光定量PCR

30 mg/kg（圖1-A）和60 mg/kg劑量（圖1-C）的反義寡聚核苷酸處理，HIF-1α mRNA水平常氧對照組和低氧處理組相比均無顯著差異，表明反義DNA基本不影響金魚HIF-1α mRNA水平。作為HIF-1α的靶基因，VEGF mRNA水平在低氧誘導下顯著上升，而30 mg/kg（圖1-B）和60 mg/kg劑量（圖1-D）的反義寡聚核苷酸處理均顯著抑制低氧對VEGF的誘導表達作用。

2.2 金魚 HIF-1多克隆抗體 ELISA檢測與Western Blot鑒定

采用間接ELISA方法檢測效價，結果顯示，經過4次免疫兔子后，獲得的血清和純化抗體效價分別達到1∶60 000和1∶20 000（圖2-A）。Western Blot檢測金魚肝臟樣本在約120 kD處出現目的條帶（圖2-B）。

2.3 反義寡聚核苷酸處理抑制金魚肝臟HIF-1的蛋白水平

Real Time PCR的結果顯示，在基因水平30，60mg/kg劑量的反義DNA基本不影響金魚HIF-1α mRNA水平，因此，挑取高劑量處理組在蛋白水平分析反義DNA對HIF-1蛋白表達的影響。從圖3可以看出，與常氧處理組相比，金魚肝臟HIF-1蛋白水平在低氧處理6 h后升高；而反義核酸藥物處理使低氧組金魚肝臟HIF-1蛋白水平與常氧處理組無顯著差異，表明所合成的反義DNA可以通過阻礙HIF-1α mRNA的翻譯，抑制金魚HIF-1蛋白的表達。

3 討論

改善實體腫瘤中的低氧微環境是目前腫瘤治療的一個方向，針對HIF-1小分子抑制劑的研發是其中的重點[10]。對于HIF-1具有抑制作用的小分子化合物已有多種，且大多都是通過級聯反應間接影響HIF-1[11]。目前已報道的HIF-1小分子抑制劑在抑制HIF-1的表達、穩定性、翻譯活性或核內運輸等過程的同時，往往還具有其他已知或未知的生理生化效應，對研究結果的分析造成一定困難。本研究首次將HIF-1反義核酸抑制劑應用于硬骨魚類，發現所合成的反義核酸能有效抑制金魚HIF-1 mRNA的翻譯及其靶基因VEGF的表達，表明HIF-1反義核酸抑制劑可在金魚低氧應答分子機制研究中發揮作用。

本研究采用金魚HIF-1α 759～774位合成多肽作為抗原制備多克隆抗體，Western Blot檢測在約120 kD處出現目的條帶（而不是根據其氨基酸序列預測的90 kD），這與哺乳動物HIF-1 Western Blot檢測結果一致[12]，可能和HIF-1α的翻譯后修飾有關。作為鯉形目魚類第一個HIF-1多克隆抗體，金魚HIF-1抗體的制備有助于硬骨魚類特別是鯉科魚類HIF-1蛋白水平的表達調控分析。

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Effect of HIF-1 Antisense Oligonucleotide Inhibitor on the Expression Level of HIF-1α and Its Target Gene VEGF in Goldfish

GUOXiaoping，ZHOU Yini，CAOYibin
（CollegeofChemistryandLifeSciences，ZhejiangNormal University，Jinhua321004，China）

Goldfish may be the most hypoxia-tolerant freshwater fish in teleost,and hypoxia induced factor（HIF-1）is a master regulator of oxygen homeostasis in animals.Until now,there is still noreport on the HIF-1 inhibitor in teleost.This study analyzed the effectofHIF-1antisenseoligonucleotideinhibitorontheexpressionofHIF-1α anditstargetgeneVEGF inlivertissuesofgoldfish.Real timePCR showedthatantisenseoligonucleotideatadoseof30mg/kgand60mg/kgcouldbotheffectivelydown-regulatethemRNA level of VEGF.However,treatment with antisense oligonucleotide had no detectable effect on HIF-1α mRNA levels under hypoxia.A polyclonal antibody for goldfish HIF-1 was produced and implied in Western Blot analysis.Antisense oligonucleotide at a dose of 60 mg/kg inhibited the hypoxia-induced up-regulation of HIF-1 protein levels in liver tissues of goldfish,which suggested that the antisense oligonucleotide inhibitor could specially repress the translation of HIF-1α mRNA.The production of HIF-1 antibody and antisenseoligonucleotideinhibitorcouldofferauseful waytoinvestigatethemolecularmechanismofhypoxiatoleranceingoldfish.

HIF-1;antisensenucleic acid;hypoxia;goldfish

S965.811

A

1002-2481（2016）07-0914-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.06

2016-02-26

國家自然科學基金項目（31371209）

郭曉萍（1989-），女，安徽宿州人，在讀碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。周旖旎為共同第一作者。曹詣斌為通信作者。