茶樹(shù)紫陽(yáng)種RbcL基因片段的克隆與序列分析

張妍，楊金宏

（安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康725099）

茶樹(shù)紫陽(yáng)種RbcL基因片段的克隆與序列分析

張妍，楊金宏

（安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康725099）

RbcL基因是綠色植物進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵基因，其序列是分子系統(tǒng)學(xué)研究中使用最為廣泛的分子標(biāo)記之一。利用PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了茶樹(shù)紫陽(yáng)種RbcL基因744 bp的序列。對(duì)來(lái)自山茶科7個(gè)樣品的RbcL序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)聚類(lèi)分析。結(jié)果顯示，山茶屬的白毛變種、金花茶和丹寨禿茶首先與紫陽(yáng)茶聚合，其他山茶科植物位于核心聚類(lèi)群的外圍。以大頭茶RbcL基因?yàn)閰⒄眨M(jìn)行山茶屬植物SNP位點(diǎn)的分析，結(jié)果顯示，在所比對(duì)的744 bp的序列中，山茶屬共存在10個(gè)SNP位點(diǎn)，其中，同義替換4個(gè)，非同義替換6個(gè)。

茶樹(shù)紫陽(yáng)種；RbcL基因；序列分析

DNA條形碼（DNA barcoding）是根據(jù)生物的遺傳物質(zhì)序列種內(nèi)變異小于種間變異而實(shí)現(xiàn)物種鑒定的一種方法[1]。通過(guò)利用1個(gè)或幾個(gè)DNA片段序列對(duì)物種進(jìn)行識(shí)別和鑒定，具有快速、準(zhǔn)確、客觀(guān)性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以避免在傳統(tǒng)鑒定方法中人為因素所造成的主觀(guān)誤判，能夠提高鑒定的效率和準(zhǔn)確性。RbcL基因的編碼蛋白是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCo）的活性中心，在光合和光呼吸過(guò)程中起重要作用，其含量占綠色植物葉片總蛋白的50%，是自然界中含量最豐富的蛋白質(zhì)[2]。RbcL基因不具有內(nèi)含子，位于葉綠體基因組的大單拷貝區(qū)（LSC），以單拷貝形式存在，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在綠色植物的系統(tǒng)進(jìn)化研究中。迄今為止，已經(jīng)測(cè)定了被子植物、裸子植物、苔蘚、海藻、光合細(xì)菌等多種不同材料中的RbcL基因序列[3]。

陜西安康的紫陽(yáng)茶產(chǎn)區(qū)以紫陽(yáng)縣為中心，地處秦嶺南坡，大巴山北麓，具有適宜種茶的土壤條件、氣候和品種資源優(yōu)勢(shì)，是我國(guó)長(zhǎng)江以北的重要產(chǎn)茶區(qū)之一[4]。紫陽(yáng)群體種原產(chǎn)地包括安康的紫陽(yáng)、平利、漢陰、旬陽(yáng)、漢濱、石泉、嵐皋、鎮(zhèn)坪等縣區(qū)，以及漢中的鎮(zhèn)巴、西鄉(xiāng)等地區(qū)，主要分布在海拔1 000 m以下的河谷、丘陵、低山等地帶，是該茶區(qū)分布最廣的一個(gè)群體。紫陽(yáng)種選育自紫陽(yáng)群體種中葉類(lèi)櫧葉種，是全國(guó)推廣的良種，各種有益成分高，自然品質(zhì)好，硒含量豐富，現(xiàn)人工種植已經(jīng)遍布陜西全省，其產(chǎn)量約占陜西省總產(chǎn)量的3/4[5]。

微量元素硒與人體免疫功能、抗氧化能力、抗癌作用等密切相關(guān)[6]。近年來(lái)，因紫陽(yáng)地處富硒帶，紫陽(yáng)富硒茶發(fā)展勢(shì)頭十分強(qiáng)勁，2014年全縣產(chǎn)茶4 565 t，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值7.5億元，市場(chǎng)前景廣闊[7]。但同時(shí)以非紫陽(yáng)茶冒充紫陽(yáng)茶等的不良市場(chǎng)行為也日益突出，嚴(yán)重?fù)p害了紫陽(yáng)茶的信譽(yù)及消費(fèi)者的利益。茶葉品種是成品茶品質(zhì)的基礎(chǔ)，因此，對(duì)茶葉品質(zhì)有效鑒別的前提是對(duì)成品茶的茶樹(shù)品種進(jìn)行鑒別。如何從技術(shù)上對(duì)成品茶進(jìn)行有效鑒別、維護(hù)茶葉市場(chǎng)的正常秩序、促進(jìn)紫陽(yáng)茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究成功地克隆了茶樹(shù)紫陽(yáng)種RbcL基因片段，并利用多序列比對(duì)技術(shù)對(duì)不同茶葉品種的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了分析，找到了紫陽(yáng)種特有的SNP位點(diǎn)，并進(jìn)一步對(duì)RbcL基因的適應(yīng)性進(jìn)化進(jìn)行研究，旨在為紫陽(yáng)群體種的來(lái)源和紫陽(yáng)茶的鑒定提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為紫陽(yáng)種陜茶一號(hào)茶葉成品，購(gòu)自安康市漢水韻茶葉有限公司[8]。

1.2 主要試劑

大腸桿菌DH5α由陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司，HP植物DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，EcoR I限制酶、Taq DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒、DNA marker（DL2 000，λ-EcoT14Ⅰdigest）等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，pGEM-T Easy Vector購(gòu)自Promega公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 紫陽(yáng)茶基因組DNA提取和RbcL基因的PCR擴(kuò)增稱(chēng)取茶葉干燥成品50 mg，加液氮冷凍研磨，后使用植物DNA提取試劑盒提取茶葉總DNA；同時(shí)用同樣的方法提取鮮葉基因組作為質(zhì)量對(duì)照。根據(jù)常用的RbcL基因序列擴(kuò)增引物和NCBI登錄的茶葉葉綠體基因組序列設(shè)計(jì)引物，其序列分別為RbcLF：5′-TTATGTCACCACAAACAGAAAC-3′；RbcLR：5′-TTCGCATGTACCTGCAGTAGC-3′。以提取的干燥成品基因組DNA為模板和設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 紫陽(yáng)茶葉RbcL基因的克隆鑒定和測(cè)序利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，并與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，送上海生工武漢測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。所有步驟均按試劑使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 RbcL基因的序列分析NCBI在線(xiàn)BLAST對(duì)紫陽(yáng)種茶葉的RbcL基因序列進(jìn)行比對(duì)，并下載山茶科的相關(guān)序列（表1），采用Clustal X1.83軟件分別進(jìn)行多序列比對(duì)[9]，采用BoxShade 3.21[10]對(duì)比對(duì)的序列文件進(jìn)行描影和打印，統(tǒng)計(jì)山茶屬內(nèi)植物的SNP位點(diǎn)。采用Mega 5.0軟件構(gòu)建山茶科內(nèi)基于RbcL基因的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，計(jì)算1 000次的自展支持值[11]。

表1 所使用的序列及其登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 紫陽(yáng)種成品茶RbcL基因PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序結(jié)果

HP植物DNA提取試劑盒（OMEGA）是基于CTAB法[12]的植物基因組提取試劑盒，利用該試劑盒可以成功地提取茶葉成品中的基因組DNA，與鮮葉比較發(fā)現(xiàn)，雖然有部分基因組的降解，但主帶明顯，可以用于PCR等下游實(shí)驗(yàn)（圖1-A）。以提取的紫陽(yáng)種成品茶葉基因組DNA為模板，利用RbcLF和RbcLR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約750 bp處出現(xiàn)單一擴(kuò)增條帶（圖1-B），與預(yù)期大小相符。回收該條帶并進(jìn)行克隆，陽(yáng)性克隆經(jīng)限制性酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)載體和目的片段條帶（圖1-C），表明克隆成功。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，獲得了RbcL基因自起始密碼子起始的長(zhǎng)744 bp的序列（Genbank登錄號(hào)：KR296794），表明利用該方法可以成功獲得成品茶葉RbcL基因的序列。

2.2 RbcL基因的多序列比對(duì)SNP分析

在線(xiàn)BLAST比對(duì)分析結(jié)果顯示，茶樹(shù)紫陽(yáng)種RbcL基因與其他山茶屬植物的同源區(qū)域的相似性在98%以上，保守性較高。以大頭茶屬大頭茶的RbcL基因?yàn)閰⒄眨治錾讲鑼僦参锏腟NP位點(diǎn)，結(jié)果顯示，在所比對(duì)的744 bp序列中，本研究的6個(gè)山茶科植物中共存在10個(gè)SNP位點(diǎn)，其中，發(fā)現(xiàn)2個(gè)紫陽(yáng)種獨(dú)有的SNP位點(diǎn)（圖2）。在所有SNP位點(diǎn)中，沒(méi)有造成氨基酸變化的同義替換（Ks）位點(diǎn)有4個(gè)，造成氨基酸變化的非同義替換（Ka）位點(diǎn)有6個(gè)，多于Ks位點(diǎn)數(shù)，顯示其進(jìn)化可能受到正選擇壓力。

2.3 RbcL基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

下載其他山茶科植物的RbcL基因同源區(qū)域的序列進(jìn)行Clustal X比對(duì)和系統(tǒng)聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，來(lái)自山茶科山茶屬的白毛變種、金花茶和丹寨禿茶首先與紫陽(yáng)茶聚合，然后與生于海拔2 200 m以上的五柱滇山茶聚合，來(lái)自大頭屬的大頭茶和木荷樹(shù)屬的港口木荷分別位于核心聚類(lèi)群的外圍（圖3）；金花茶和白毛變種樹(shù)枝分歧的分值低于500，說(shuō)明該基因非常保守，可能經(jīng)歷回復(fù)突變；靠近根部的自展支持值普遍高于樹(shù)枝末梢，說(shuō)明該基因適合用于屬間的遺傳進(jìn)化分析，不適合用于屬內(nèi)親緣關(guān)系近的物種的遺傳分析。

3 討論與結(jié)論

DNA條形碼作為一種新的分類(lèi)系統(tǒng)，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)進(jìn)化和分類(lèi)方法的不足，加快全球生物物種系統(tǒng)進(jìn)化和鑒定的步伐，其自Hebert于2003年提出后，已經(jīng)在動(dòng)物、植物、真菌和藻類(lèi)等的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中發(fā)揮了重要作用。在植物中，RbcL，MatK，ITS是目前使用較多的DNA條形碼候選序列，但對(duì)每一植物科、屬或種內(nèi)都需進(jìn)行針對(duì)性的研究和探索[13]。茶樹(shù)是典型的異花授粉植物，容易發(fā)生雜交和網(wǎng)狀進(jìn)化，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的人工和自然選擇，遺傳背景非常復(fù)雜，各品種間擁有豐富的遺傳多樣性[14]。本研究結(jié)果表明，金花茶和白毛變種樹(shù)枝分歧的分值僅為256，低于500，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而且靠近進(jìn)化樹(shù)根部的自展支持值普遍高于樹(shù)枝末梢，說(shuō)明在分歧較晚的物種間，該基因的進(jìn)化位點(diǎn)較少，不適合單獨(dú)用于系統(tǒng)發(fā)育分析，需要聯(lián)合其他條形碼序列。

茶葉品種是形成成品茶品質(zhì)的關(guān)鍵，但“掛羊頭賣(mài)狗肉”的不良行為屢見(jiàn)不鮮，如以紅茶代替金駿眉、以巖茶代替大紅袍、以普通綠茶冒充紫陽(yáng)富硒綠茶，嚴(yán)重破壞了茶葉市場(chǎng)，因此，如何進(jìn)行有效的茶葉品種鑒定是急需解決的問(wèn)題。陳海軍等[15]應(yīng)用隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（RAPD）對(duì)目前浙江推廣的10個(gè)優(yōu)良茶樹(shù)品種進(jìn)行分析，結(jié)果表明，引物S16能在各個(gè)品種擴(kuò)增后產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，可以用來(lái)鑒別這些品種。陳春梅[16]利用葉綠體基因psbA，ycf15和trnL-F間隔區(qū)對(duì)山茶屬植物13個(gè)種進(jìn)行鑒別發(fā)現(xiàn)，ycf15和psbA基因序列在所選材料中SNP位點(diǎn)并不豐富，不適合用于山茶屬植物種間的鑒定，trnL-F間隔區(qū)序列進(jìn)化速率較快，可用于山茶屬不同種間的親緣關(guān)系研究。本研究成功獲得了紫陽(yáng)種成品RbcL基因744 bp的核苷酸序列，可以通過(guò)一個(gè)Sanger測(cè)序獲得該片段DNA信息，在山茶科內(nèi)，該片段具有明顯的種間變異，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)SNP位點(diǎn)，而且2個(gè)是紫陽(yáng)種特有的SNP位點(diǎn)，符合理想DNA條形碼的條件，可以用于紫陽(yáng)種和紫陽(yáng)茶的鑒定。

Ks一般不受選擇的影響，Ka的突變則因選擇壓力的不同而差異較大。在蛋白質(zhì)水平上，Ks/Ka的值可以用來(lái)判斷該基因的進(jìn)化是否受到自然選擇的影響[17]。RbcL基因蛋白是世界上最豐富的蛋白質(zhì)，其進(jìn)化和起源具有重要的意義。有研究針對(duì)水龍骨科49種植物所進(jìn)行的相似分析中得到了7個(gè)位點(diǎn)受到正選擇壓力[18]。陳潔等[19]基于分支模型對(duì)42種蕨類(lèi)植物的RbcL基因所受到的選擇壓力進(jìn)行了分析，結(jié)果檢測(cè)到4個(gè)分支處于正選擇壓力下。本研究結(jié)果表明，山茶科6個(gè)種中存在10個(gè)SNP位點(diǎn)，其中，6個(gè)為非同義突變，4個(gè)為非同義突變，說(shuō)明該基因受到正選擇壓力是一個(gè)普遍的現(xiàn)象。

［1］Hebert PDN，Cywinska A，Ball S，et al.Biological identifications through DNAbarcodes[J].Proc R Soc Lond B，2003，270：313-321.

［2］Andersson I，Backlund A.Structure and function of Rubisco[J]. Plant Physiol Biochem，2008，46：275-291.

［3］Frézal L，Leblois R.Four years of DNA barcoding:current advances and prospects[J].Infect Genet Evol，2008，8：727-736.

［4］程良斌.紫陽(yáng)富硒茶研究與開(kāi)發(fā)[M].西安：陜西出版集團(tuán)，2010：103-112.

［5］李瑞.陜南茶區(qū)茶樹(shù)種質(zhì)資源鑒定與評(píng)價(jià)[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011：16-39.

［6］寧嬋娟，吳國(guó)良.微量元素硒與人體健康及我國(guó)富硒食品的開(kāi)發(fā)狀況[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（5）：88-90.

［7］程渭.今年紫陽(yáng)茶葉收入12億元[EB/OL].[2014-12-11].http: //www.zyx.gov.cn/content/detail/554ab722f9313f268ce5c874.html.

［8］余有本，王衍成，紀(jì)昌中，等.優(yōu)良茶樹(shù)新品種陜茶1號(hào)的選育[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013（7）：173-177．

［9］Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The CLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided byqualityanalysis tools[J].Nucleic Acids Res，1997，25（24）：4876-4882.

［10］Hofmann K，Baron M.Pretty printing and shading of multiple-alignment files[EB/OL].[2016-08-12].http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html.

［11］Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol，2011，28（10）：2731-2739.

［12］王嘉薈，王琳，王金勝，等.連翹生曬果實(shí)和干燥葉片總DNA提取方法比較[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（12）：1594-1597.

［13］Chase MW，Salamln N，Wilkinson M，et al.Land plants and DNA barcods:short-term and long-term goals[J].Philos Trans R Soc Lond BBiol Sci，2005，360：1889-1895.

［14］張宏達(dá).茶樹(shù)的系統(tǒng)分類(lèi)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1981（1）：87-99.

［15］陳海軍，趙東，劉祖生.浙江部分茶樹(shù)良種的RAPD分子鑒定[J].茶葉，2002，28（3）：119-121.

［16］陳春梅.基于cpDNA序列的茶樹(shù)及其近緣植物的親緣關(guān)系研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014：41-48.

［17］Kryazhimskiy S，Plotkin J B.The population genetics of dN/dS[J]. PLoSGenet，2008，4（12）：e1000304.

［18］蘇應(yīng)娟，王艇.水龍骨科附生蕨類(lèi)Rubisco大亞基的適應(yīng)性進(jìn)化：正向選擇位點(diǎn)的鑒定[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，47（5）：74-80.

［19］陳潔，張麗君，王艇.蕨類(lèi)植物rbcL基因正選擇和負(fù)選擇位點(diǎn)的鑒定[J].西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（12）：2391-2400.

Clonging and Sequence Analysis ofRbcLGene inCamellia sinensiscv.Ziyang

ZHANGYan，YANGJinhong
（College ofMordern Agriculture and Biotechnology，AnkangUniversity，the KeySericultural LaboratoryofShaanxi，Ankang725099，China）

The RbcL is the key gene to carry out photosynthesis and its sequence is widely used in molecular phylogenetic studies in green plants.UsingPCR amplification and sequencing,the paper obtained the RbcL 744 bp sequence ofCamellia sinensis cv.Ziyang. The RbcL sequences of 7 samples within Theaceae Camellia were compared and cluster analysis.The results showed that Camellia sinensis cv.Ziyang,Camellia petelotii,Camellia sinensis var.pubilimba and Camellia danzaiensis voucher preferred polymerization at the same branch,other Theaceae was in the distant branch.Polyspora axillaris as a reference,SNP analysis of RbcL gene was analyzed within Camellia L..The results showed that in the comparison of 744 bp,10 SNP loci,4 synonymous and 6 nonsynonymous replacement were detected.

Camellia sinensis cv.Ziyang;RbcL gene;sequence analysis

S571.1

A

1002-2481（2016）12-1772-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.12.08

2016-07-31

陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2016sxjy026）

張妍（1995-），女，陜西渭南人，在校學(xué)生，研究方向：植物分子標(biāo)記。楊金宏為通信作者。