耬斗菜的組織培養(yǎng)

杜艷

（運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西運(yùn)城044000）

耬斗菜的組織培養(yǎng)

杜艷

（運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西運(yùn)城044000）

以耬斗菜幼嫩葉片及葉柄為外植體，研究了不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和生根的影響。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基MS＋2，4-D1.0 mg/L＋6-BA0.5 mg/L上誘導(dǎo)葉柄產(chǎn)生愈傷效果最好，誘導(dǎo)率為80.5%；在培養(yǎng)基MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L上葉片愈傷誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率為92.7%。繼代培養(yǎng)基為MS＋2，4-D 0.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L和MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 2.0 mg/L。在培養(yǎng)基MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L中分化芽；分化的芽在MS＋NAA 0.1 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L中增殖。生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋NAA 0.1 mg/L或1/2 MS＋I(xiàn)BA0.2 mg/L。

組織培養(yǎng)；愈傷組織誘導(dǎo)；不定芽分化；生根；外植體

耬斗菜（Aquilegia viridiflora）是毛茛科（Ranunculacea）耬斗菜屬（Aquilegia）的多年生草本植物，品種繁多，資源豐富，在我國(guó)廣為分布[1]。耬斗菜不僅具有奇特花型，而且花色豐富、色澤明艷，在園林中經(jīng)常作為花壇、花境的配置材料，亦可叢植于花園、籬邊、庭院，應(yīng)用十分廣泛[2]。耬斗菜對(duì)栽培環(huán)境要求不嚴(yán)，性強(qiáng)健而耐寒[3]，具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗性強(qiáng)、觀賞性狀好等優(yōu)點(diǎn)[4]，管理相對(duì)粗放，適宜在園林中推廣應(yīng)用。其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所需的氨基酸和多種營(yíng)養(yǎng)元素。陳四保等[5]從蒙藥耬斗菜中測(cè)出17種氨基酸，其中，7種為人體必需氨基酸。邢愛英等[6]對(duì)華北樓斗菜的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，并分析了其營(yíng)養(yǎng)成分。馮衛(wèi)生等[7]以華北耬斗菜為研究對(duì)象，從中分離鑒定得到13種化合物。鞏紅冬[8]研究表明，甘肅耬斗菜族植物具有藥用價(jià)值，在治療心血管疾病、消化道疾病、子宮出血等方面具有一定功效。朱蕊蕊等[9]研究表明，耬斗菜根含有糖類，可制飴糖或釀酒；種子含油，可供工業(yè)使用。因此，耬斗菜不僅具有園林應(yīng)用價(jià)值，而且具有藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

隨著耬斗菜的園林應(yīng)用及營(yíng)養(yǎng)藥用價(jià)值逐漸被人們所關(guān)注，其栽培管理及繁殖方法的研究也開始增多。耬斗菜除了通過(guò)傳統(tǒng)的播種、分株等繁殖方法進(jìn)行育苗以外，組織培養(yǎng)作為一種常用的快繁方式也開始應(yīng)用于耬斗菜上。組織培養(yǎng)除了具有快速、大量繁殖的優(yōu)點(diǎn)外，還可以通過(guò)組織培養(yǎng)獲得無(wú)病毒苗。朱蕊蕊等[9]以耬斗菜為試驗(yàn)材料，從不同外植體和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)其愈傷組織和不定芽再生的影響等方面進(jìn)行了研究，李群等[10]、李春玲等[11]以園藝品種耬斗菜的葉片為外植體建立了繁殖體系，王非等[12]以尖萼耬斗菜葉片建立了繁殖體系。

本試驗(yàn)以耬斗菜幼嫩葉片及葉柄為外植體，從不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化和生根的影響等進(jìn)行研究，旨在篩選出最佳培養(yǎng)基配比，建立以葉片和葉柄為外植體的繁殖體系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試耬斗菜品種為泛美八音鳥，種子從美國(guó)泛美種子公司分銷處購(gòu)買。

1.2 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為MS，蔗糖3%，瓊脂0.65%，pH值為6.0。培養(yǎng)條件：光照強(qiáng)度1 000 lx，每日光照16 h，黑暗8 h，室溫25℃。

1.3 無(wú)菌材料的獲得

取耬斗菜種子，在1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行播種，待長(zhǎng)出4～5片真葉時(shí)，取其葉片和葉柄作為外植體，設(shè)為A組。從具有4～5片真葉的露地栽培苗上剪切嫩葉葉片、葉柄作為外植體。先用流水將外植體表面污物沖洗掉，再用洗潔精進(jìn)行清洗，并用流水沖洗2h，然后對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理。處理方法：先將外植體置于無(wú)菌操作臺(tái)上，用75%酒精消毒20 s，并用無(wú)菌水沖洗2～3次，再用0.1%升汞消毒處理，葉片處理3 min，葉柄處理5 min，最后用無(wú)菌水沖洗4～5次，外植體表面水分用無(wú)菌濾紙吸干。處理后的葉片剪去葉緣，葉柄剪成約2cm，設(shè)為B組。

1.4 愈傷組織誘導(dǎo)和增殖試驗(yàn)

愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基：（1）MS＋2，4-D（0.2，1.0，2.0）mg/L＋6-BA（0.5，1.0，2.0）mg/L；（2）MS＋NAA（0.2，0.5，1.0）mg/L＋6-BA（0.5，1.0，2.0）mg/L。繼代培養(yǎng)基：MS＋2，4-D 0.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L和MS＋NAA0.5 mg/L＋6-BA2.0 mg/L。

將A，B組外植體接種于培養(yǎng)基（1），（2）上，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。觀察比較不同濃度的激素配比及外植體對(duì)愈傷組織的影響，分析得出誘導(dǎo)葉柄、葉片產(chǎn)生愈傷效果最佳的培養(yǎng)基。在繼代培養(yǎng)基上增殖，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基中。

1.5 不定芽分化及增殖試驗(yàn)

不定芽分化及增殖培養(yǎng)基：（3）MS＋NAA（0.2，0.5，1.0）mg/L＋6-BA 0.5 mg/L；（4）MS＋NAA（0.1，0.3，0.5）mg/L＋6-BA0.5 mg/L。

選取質(zhì)地致密的愈傷組織，將其切分成1 cm× 1 cm大小，繼代于培養(yǎng)基（3）中，分析得出誘導(dǎo)分化芽效果最佳的培養(yǎng)基。然后將分化出的芽點(diǎn)轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基（4）中，分析得出最佳增殖培養(yǎng)基。

1.6 生根試驗(yàn)

生根培養(yǎng)基：（5）1/2MS＋NAA（0.1，0.5，1.0）mg/L；（6）1/2 MS＋I(xiàn)BA（0.2，0.5，1.0）mg/L。

芽長(zhǎng)約5 cm高時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基（5），（6）中進(jìn)行生根培養(yǎng)，找出最佳生根培養(yǎng)基。

1.7 試管苗的煉苗與移栽

幼苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30 d，待生長(zhǎng)健壯時(shí)開始進(jìn)行煉苗、移栽。移栽的混合基質(zhì)配比為：珍珠巖∶草炭∶園土＝8∶1∶1[13]。

2 結(jié)果與分析

表1 不同質(zhì)量濃度的激素配比及外植體對(duì)愈傷組織的影響

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖的影響

外植體培養(yǎng)5 d左右時(shí)，葉柄兩端開始膨大，葉片出現(xiàn)皺縮；培養(yǎng)10 d左右時(shí)，葉片邊緣及葉柄兩端陸續(xù)形成愈傷組織，愈傷組織的出現(xiàn)方式同毛茛科大花飛燕草[14]和花毛茛的方式相同[15]。

由表1，2可知，比較培養(yǎng)基（1），（2）中的愈傷組織生長(zhǎng)情況，首先，葉片的出愈率顯著大于葉柄的；其次，B組葉柄（室外采摘）形成愈傷組織能力強(qiáng)于A組（組培苗），A組葉片形成誘導(dǎo)愈傷組織能力強(qiáng)于B組；第三，2，4-D對(duì)于誘導(dǎo)葉柄形成愈傷組織更有利，NAA對(duì)于誘導(dǎo)葉片形成愈傷組織效果更好；第四，培養(yǎng)基（1）上出現(xiàn)愈傷組織相對(duì)較晚，且愈傷量小，愈傷組織呈現(xiàn)黃色。

總之，愈傷組織誘導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基MS＋2，4-D 1.0 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L上誘導(dǎo)葉柄產(chǎn)生愈傷效果最好，誘導(dǎo)率為80.5%；在培養(yǎng)基MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L上，誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷效果最好，誘導(dǎo)率為92.7%。繼代每20 d左右進(jìn)行一次，愈傷組織增殖較快，質(zhì)地密集緊實(shí)。繼代增殖3～4次后將愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基中。

表2 不同質(zhì)量濃度的激素配比及外植體對(duì)愈傷組織的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽的分化和增殖的影響

表3 不同質(zhì)量濃度NAA與6-BA對(duì)不定芽分化的影響

表4 不同質(zhì)量濃度NAA與6-BA對(duì)不定芽增殖的影響

愈傷組織繼代于培養(yǎng)基（3）中15 d后，分化出綠色芽點(diǎn)。在培養(yǎng)基MS＋NAA 0.2 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L中，芽分化時(shí)亦出現(xiàn)根的分化；在培養(yǎng)基MS＋NAA 1.0 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L中，出現(xiàn)愈傷組織褐化現(xiàn)象，甚至有畸形的葉和芽分化。在培養(yǎng)基MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L中，誘導(dǎo)分化芽的效果最好，分化率達(dá)58.60%（表3）。在培養(yǎng)基MS＋NAA 0.1 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L中，芽的長(zhǎng)勢(shì)好，分化較快，20 d后增殖倍數(shù)達(dá)6.59（表4）。隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，芽的增殖倍數(shù)下降，且不定芽葉片出現(xiàn)黃色，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度達(dá)0.5 mg/L時(shí)，少許葉片逐漸呈現(xiàn)枯萎狀，而新生叢生芽生長(zhǎng)狀態(tài)較差。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)生根的影響

生根培養(yǎng)20 d后，所有幼苗基部均生出白色根系。隨著NAA，IBA質(zhì)量濃度的增加，幼苗基部須根生成數(shù)量減少，葉片逐漸枯萎，并且有愈傷組織出現(xiàn)。

從表5，6可以看出，在培養(yǎng)基1/2 MS＋NAA 0.1 mg/L或1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L上，幼苗基部均產(chǎn)生較多的叢生根，無(wú)顯著差異。

表5 NAA對(duì)耬斗菜生根的影響

表6 IBA對(duì)耬斗菜生根的影響

2.4 試管苗的煉苗與移栽

首先，將培養(yǎng)瓶繩頭解開，1 d后打開培養(yǎng)瓶密封膜，在溫室內(nèi)自然光下進(jìn)行煉苗3～5 d；其次，從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，用清水將根系表面的培養(yǎng)基沖洗干凈；最后將幼苗移栽到混合基質(zhì)中，注意保濕遮陰。本試驗(yàn)的移栽成活率高達(dá)80%以上。

3 結(jié)論

本研究表明，在培養(yǎng)基MS＋2，4-D1.0 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L上誘導(dǎo)葉柄產(chǎn)生愈傷效果最好，誘導(dǎo)率為80.5%；在培養(yǎng)基MS＋NAA0.5 mg/L＋6-BA 1.0mg/L上，葉片愈傷誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率為92.7%。最適不定芽分化培養(yǎng)基為MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L中分化芽；分化的芽在MS＋NAA 0.1 mg/L＋6-BA0.5 mg/L中增殖。最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋NAA0.1 mg/L或1/2 MS＋I(xiàn)BA0.2 mg/L。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1979：490.

［2］程金水.園林植物遺傳育種學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2000.

［3］李曉博，李寧毅.耬斗菜的栽培管理[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：55.

［4］陳菲，劉曉東，栗輝.耬斗菜屬植物在城市園林中開發(fā)應(yīng)用研究[J].國(guó)土與自然資源研究，2010（2）：96-97.

［5］陳四保，王立為，楊峻山，等.耬斗菜族藥用植物化學(xué)成分及資源利用概況[J].中草藥，2001，32（11）：附3-4.

［6］邢愛英，于桂琴，張林，等.華北耬斗菜的生物學(xué)特性及其營(yíng)養(yǎng)成分[J].山東林業(yè)科技，1998（3）：16-17.

［7］馮衛(wèi)生，蘇芳誼，鄭曉珂，等.華北耬斗菜的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46（7）：496-499.

［8］鞏紅冬.甘肅耬斗菜藥用植物資源研究[J].甘肅科技，2007，7（7）：23.

［9］朱蕊蕊，楊?yuàn)檴櫍鲿裕?耬斗菜愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的初步研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（7）：85-86.

［10］李群，趙富群，陳麗萍，等.耬斗菜的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊，2009，45（1）：45-46.

［11］李春玲，蔣鐘仁.早春野生花卉組織培養(yǎng)研究初報(bào)[J].園藝學(xué)報(bào)，1992，10（3）：277-278.

［12］王非，姜思佳，李忠才，等.尖萼耬斗菜外植體消毒及愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（35）：19922-19924.

［13］杜艷.不同基質(zhì)對(duì)耬斗菜幼苗質(zhì)量的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：375-377.

［14］何小玲，王金發(fā).大花飛燕草的組織培養(yǎng)及植株再生[J].植物生理學(xué)通訊，1998，34（1）：39.

［15］李洪忠，彭世勇，于艷，等.花毛茛葉片組織培養(yǎng)的初步探索[J].遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6（3）：4.

The Tissue Culture ofAquilegia

DUYan
（YunchengAgriculture Vocational and Technical College，Yuncheng044000，China）

To study the effect on the callus induction adventitious buds differentiation and rooting in different growth regulating substances,the paper chose leaves and petioles of Aquilegia as explants.The result showed that in the medium MS＋2,4-D 1.0 mg/L＋6-BA0.5 mg/L,the petiole could produce the best callus induction,the induction rate was 80.5%.In the mediumMS＋NAA0.5 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L,the leaf could produce the best callus induction,the induction rate was 92.7%.Subculture medium were MS＋2,4-D 0.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L and MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 2.0 mg/L.In the medium MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L,callus induction turned tobud differentiation.The bud proliferate was in MS＋NAA 0.1 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L.Rootingmediumwas 1/2 MS＋NAA0.1 mg/Lor 1/2 MS＋I(xiàn)BA0.2 mg/L.

tissue culture;callus induction;adventitious buds differentiation;rooting;explant

S682.1

A

1002-2481（2016）12-1776-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.12.09

2016-08-28

杜艷（1980-），女，山西運(yùn)城人，講師，主要從事花卉植物栽培與應(yīng)用研究工作。