鹽酸吡格列酮對(duì)2型糖尿病患者外周血循環(huán)祖細(xì)胞水平的影響及機(jī)制

鄒叢，胡曉琴，劉宏洋，劉澤林，涂云明，胡鳳

(1南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，南昌330003；2南昌大學(xué)附屬眼科醫(yī)院)

鹽酸吡格列酮對(duì)2型糖尿病患者外周血循環(huán)祖細(xì)胞水平的影響及機(jī)制

鄒叢1，胡曉琴2，劉宏洋1，劉澤林1，涂云明1，胡鳳1

(1南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，南昌330003；2南昌大學(xué)附屬眼科醫(yī)院)

目的 探討2型糖尿病(T2DM)患者外周血循環(huán)祖細(xì)胞水平變化及鹽酸吡格列酮對(duì)循環(huán)祖細(xì)胞的影響。方法 選擇T2DM患者50例，隨機(jī)分為治療組30例和對(duì)照組20例。對(duì)照組采用常規(guī)控制血糖治療，治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用鹽酸吡格列酮片口服，兩組均治療12周。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組治療前后外周血白細(xì)胞膜上CD34+的表達(dá)，計(jì)數(shù)循環(huán)祖細(xì)胞；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組治療前后血清內(nèi)皮素1(ET-1)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平；采用一氧化氮硝酸還原酶法檢測(cè)兩組治療前后血清一氧化氮(NO)水平。結(jié)果 治療前，兩組外周血循環(huán)祖細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，治療組外周血循環(huán)祖細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組(P<0.05)。治療前，兩組血清ET-1、hs-CRP及NO水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。治療后，治療組血清ET-1、hs-CRP水平低于同組治療前及對(duì)照組，血清NO水平高于同組治療前及對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 鹽酸吡格列酮可升高T2DM患者的外周血循環(huán)祖細(xì)胞數(shù)量，降低血清ET-1、hs-CRP水平，升高血清NO水平。

2型糖尿病；吡格列酮；循環(huán)祖細(xì)胞；超敏C反應(yīng)蛋白；內(nèi)皮素1；一氧化氮

2型糖尿病(T2DM)患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥是大血管和微血管病變，其嚴(yán)重程度與血管內(nèi)皮損傷和功能障礙的程度密切相關(guān)。研究表明，糖尿病時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后的修復(fù)細(xì)胞主要來(lái)源于循環(huán)祖細(xì)胞[1]。循環(huán)祖細(xì)胞的主要功能為保護(hù)血管內(nèi)皮的完整性和促進(jìn)缺血組織的再血管化。研究發(fā)現(xiàn)，在高血糖環(huán)境下，循環(huán)祖細(xì)胞數(shù)量和功能均降低[3]。CD34被作為循環(huán)祖細(xì)胞分子的標(biāo)志物[2]。鹽酸吡格列酮是常用的降糖藥物，其作用機(jī)制為通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)，影響參與糖代謝的關(guān)鍵酶和蛋白基因的表達(dá)，在降低血糖的同時(shí)還具有改善血管內(nèi)膜、延緩動(dòng)脈粥樣硬化的作用[4]。鹽酸吡格列酮改善血管內(nèi)膜的作用是否與調(diào)節(jié)外周血循環(huán)祖細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。2015年7月～2016年6月，我們對(duì)30例T2DM患者采用鹽酸吡格列酮治療，觀察對(duì)患者外周血循環(huán)祖細(xì)胞、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、內(nèi)皮素1(ET-1)、一氧化氮(NO)的影響，探討鹽酸吡格列酮改善T2DM患者血管內(nèi)皮功能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在我院治療的T2DM患者50例，男26例、女24例，年齡40～70(58.5±4.3)歲。均符合1999年WHO制定的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。患者均無(wú)微血管和大血管病變，病程1～2年。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿??；近期發(fā)生過(guò)各種炎癥性疾??；長(zhǎng)期口服降膽固醇藥物；妊娠期婦女；大量吸煙(每日吸煙量超過(guò)1包)；肝腎功能不全；有糖尿病急性并發(fā)癥及慢性并發(fā)癥；有冠心病及其他心血管系統(tǒng)疾病，伴或不伴心功能不全。隨機(jī)分為治療組30例、對(duì)照組20例。兩組性別、年齡等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 治療方法 對(duì)照組給予常規(guī)控制血糖治療，包括調(diào)整飲食、適量運(yùn)動(dòng)、合理選擇口服降糖藥(包括磺脲類、非磺脲類促泌劑、α糖苷酶抑制劑、雙胍類降糖藥物等)。治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用吡格列酮30 mg口服，1次/d。兩組均治療12周。根據(jù)血糖水平調(diào)整治療方案，使糖化血紅蛋白(HbA1c)穩(wěn)定在8%以內(nèi)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 外周血循環(huán)祖細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以外周血白細(xì)胞膜上CD34+的表達(dá)計(jì)數(shù)循環(huán)足細(xì)胞。取兩組患者治療前后靜脈全血100 μL，EDTA抗凝，置于FCM測(cè)量管中。用三色直接免疫熒光法標(biāo)記，加入CD34+-FITC熒光單抗，避光孵育20 min，加入溶紅細(xì)胞液，充分混勻，反應(yīng)20 min。以1 500 r/min離心5 min，去上清；用PBS洗1遍，收集細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，以CD34+細(xì)胞數(shù)占白細(xì)胞總數(shù)的比例計(jì)數(shù)循環(huán)足細(xì)胞。

1.3.2 血清ET-1、hs-CRP、NO水平檢測(cè) 取兩組患者治療前后外周靜脈全血100 μL，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血清ET-1、hs-CRP水平，采用一氧化氮硝酸還原酶法檢測(cè)血清NO水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血循環(huán)祖細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 治療前，兩組外周血循環(huán)祖細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，治療組外周血循環(huán)祖細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 兩組血清ET-1、hs-CRP及NO水平比較 治療前，兩組患者血清ET-1、hs-CRP及NO水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。治療后，治療組血清ET-1、hs-CRP水平低于同組治療前及對(duì)照組，血清NO水平高于同組治療前及對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)、ET-1、hs-CRP及NO水平比較

注：與對(duì)照組治療后比較，*P<0.05；與同組治療前比較，△P<0.05。

3 討論

糖尿病血管病變與血管內(nèi)皮損傷及其功能障礙有密切關(guān)系。內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于高血糖的環(huán)境中，可引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生葡萄糖氧化，使活性氧大量生成，導(dǎo)致糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化貯備明顯降低[5]。近年來(lái)，循環(huán)祖細(xì)胞與T2DM血管病變的關(guān)系引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。

循環(huán)祖細(xì)胞是指來(lái)自骨髓、循環(huán)于外周血中、具有祖細(xì)胞特征的單個(gè)核細(xì)胞，是一個(gè)混合的祖細(xì)胞群體，形態(tài)缺乏特征，不易與其他單個(gè)核細(xì)胞區(qū)別。在生理或病理因素刺激下，循環(huán)祖細(xì)胞可從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血管的修復(fù)。CD34是高度糖基化的跨膜糖蛋白，可以選擇性地表達(dá)于各種造血祖細(xì)胞膜上，被認(rèn)為是反映循環(huán)祖細(xì)胞水平的標(biāo)志[6]。越是早期的造血祖細(xì)胞，CD34+表達(dá)越高；隨細(xì)胞分化、成熟，CD34+表達(dá)逐漸減少直至消失。最近研究表明，循環(huán)中骨髓來(lái)源的CD34+細(xì)胞是內(nèi)皮祖細(xì)胞的來(lái)源，是與促進(jìn)血管生成有關(guān)的細(xì)胞因子的重要來(lái)源[7]。研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病及T2DM患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)目均減少，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖功能受損[8]。Fadini等[5]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者外周血循環(huán)祖細(xì)胞減少與患者發(fā)生血管損傷有關(guān)。本課題組前期研究表明，T2DM患者外周血CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，且發(fā)生微血管病變的T2DM患者CD34+細(xì)胞計(jì)數(shù)低于單純T2DM患者，提示T2DM患者發(fā)生微血管病變可能與循環(huán)祖細(xì)胞的數(shù)量減少密切相關(guān)[9]。因此，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的循環(huán)祖細(xì)胞，其與T2DM血管病變的關(guān)系不容忽視。

鹽酸吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物，其作用機(jī)制為通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)外周組織和肝臟對(duì)胰島素的敏感性，從而降低血糖水平。鹽酸吡咯列酮也可通過(guò)激活PPAR-γ，影響參與糖代謝的關(guān)鍵酶和蛋白基因的表達(dá)，使引起胰島素的有關(guān)因子如瘦素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和抵抗素減少[10]，從而改善胰島素抵抗和高胰島素血癥，降低血糖水平。近年研究發(fā)現(xiàn)，噻唑烷二酮類藥物還具有改善T2DM患者血管內(nèi)膜的作用，能夠延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[4]。應(yīng)用吡格列酮后，T2DM患者血糖水平顯著降低，與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的指標(biāo)如胰島素抵抗指數(shù)、CRP、PAI-1、P-選擇素等均顯著下降，提示吡格列酮可能具有預(yù)防大血管并發(fā)癥的作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組治療后外周血循環(huán)祖細(xì)胞計(jì)數(shù)高于對(duì)照組，提示吡格列酮對(duì)循環(huán)祖細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。

循環(huán)祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，是干細(xì)胞分化成熟過(guò)程中的一個(gè)階段。研究發(fā)現(xiàn)，存在于外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞可能參與血管內(nèi)皮損傷后的修復(fù)、血管的新生和損傷血管的再內(nèi)皮化過(guò)程，對(duì)維持血管穩(wěn)定的生物學(xué)功能具有重要作用[12]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙出現(xiàn)在早期糖尿病患者中，內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化的早期標(biāo)志。糖尿病是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的因素，占糖尿病患者死亡原因的60%～70%[13]。NO、ET-1和hs-CRP等炎癥介質(zhì)是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因子[14]。動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，產(chǎn)生NO能力下降，ET-1增多，引起血管舒張功能受損、血管痙攣，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[15]。ET-1和hs-CRP與血管平滑肌細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及其嚴(yán)重程度有明顯的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮治療組治療前血清ET-1、hs-CRP水平均升高，NO水平降低，治療后血清ET-1、hs-CRP水平均降低，NO水平升高，提示吡格列酮具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，能一定程度上改善動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)指標(biāo)。而吡格列酮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明，是否通過(guò)動(dòng)員循環(huán)祖細(xì)胞參與損傷后血管新生與修復(fù)，進(jìn)而改善動(dòng)脈硬化，需要進(jìn)一步的探討。

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2016-07-27)