微波等離子體炬質譜法快速測定大米中黃曲霉毒素B1的研究

蔣 濤，李 云，趙曉靜，肖賽金，楊水平，朱志強

(1.東華理工大學 江西省質譜科學與儀器重點實驗室，江西 南昌 330013；2.上饒師范學院 化學與化工學院，江西 上饒 334001)

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研究簡報

微波等離子體炬質譜法快速測定大米中黃曲霉毒素B1的研究

蔣 濤1，李 云1，趙曉靜1，肖賽金1，楊水平1，朱志強2*

(1.東華理工大學 江西省質譜科學與儀器重點實驗室，江西 南昌 330013；2.上饒師范學院 化學與化工學院，江西 上饒 334001)

以微波等離子體炬(MPT)為離子化源，在無需樣品預處理的條件下，建立了快速測定大米中黃曲霉毒素B1(AFB1)的直接質譜分析方法。在正離子檢測模式下，根據黃曲霉毒素B1的特征質譜離子(m/z285)進行定量分析。結果表明，黃曲霉毒素B1在0.5～20 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數(r2)為0.999 4，方法檢出限為0.12 μg/kg。直接檢測復雜基體大米中的黃曲霉毒素B1，平均回收率為95.8%～107.2%，相對標準偏差(RSD，n=9)為2.2%～10.1%；將該方法與主成分分析(PCA)相結合，能夠準確地鑒別大米是否霉變。該方法分析速度快、靈敏度高，適合霉變大米的快速、高通量篩查，有望應用于糧油食品、動植物食品質量監控等領域。

微波等離子體炬(MPT)；質譜；黃曲霉毒素B1(AFB1)；大米

大米是人類最重要的主食之一，其質量的好壞直接關系到食用者的身體健康。近年來，毒大米事件引起人們對大米質量的關注。毒大米主要包括米中重金屬超標、米表面含有農藥或大米發生霉變等，其中霉變大米含有劇毒物質黃曲霉毒素(Aflatoxins)。黃曲霉毒素為分子真菌毒素，主要包括黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2,M1,M2，而霉變的糧食中以黃曲霉毒素B1的毒性最大，量最多[1]，致癌性最強[2]。AFB1屬于肝臟毒素，誘發肝癌的能力比二甲基亞硝胺大75倍[1]，國際癌癥研究機構已將其列為人類致癌物[3]。根據中國食品中真菌毒素的限量規定，大米中黃曲霉毒素的含量不得超過10 μg/L[4]。因此很有必要對大米中黃曲霉毒素B1進行嚴格的監測。

目前國內外檢測黃曲霉毒素B1的方法主要有薄層色譜法[5]、毛細管電泳[6]、免疫化學分析方法[7-8]和色譜-質譜法[9-11]等，這些方法需復雜的預處理過程。大氣常壓質譜技術是近年來發展的可快速分析復雜基體樣品的質譜方法，如電噴霧解吸電離(DESI)[12]、實時在線分析(DART)[13]、電噴霧萃取電離(EESI)[14]、表面解吸常壓化學電離(DAPCI)[15]以及低溫等離子體探針(LTP)[16]等，這些方法可在無需樣品預處理或少量樣品預處理的條件下高通量、高靈敏地分析原生態的樣品，但很少直接用于大米中黃曲霉毒素的分析檢測。

圖1 MPT-MS實驗裝置示意圖Fig.1 Experimental schematic of MPT-MS

微波等離子體炬(MPT)是由金欽漢教授課題組發明和發展的一種新興等離子產生裝置。本文將該技術應用于質譜離子化源，發掘其在質譜中的應用潛力。如圖1所示，MPT炬管是三管同軸的結構。從微波能傳輸的角度看，可將這種炬管看成是一端開放的同軸線；在其開放的一端向外,電場分布和流體動力學均有利于形成一個具有中央通道的等離子體[17]。這種結構設計類似于ICP離子源，但其三管均為金屬制成[18]。而且當MPT以微波作為能量來源時，與傳統的微波等離子體(MWP)類似，易形成常壓下Ar,N2甚至空氣的等離子體[19]。故而，MPT離子源兼顧了此二者的優點，不但能克服樣品耐受力不足的缺陷，而且具有結構簡單、操作簡便、功耗低和普適性強等特點。近年來，MPT離子源不僅能檢測元素周期表上大多數元素，而且對有機化合物能進行良好的解析，因而廣泛地應用于食品安全、石油化工、臨床醫學等領域[20-21]。以MPT為離子源，與多種質譜儀器(LTQ，TOF)相結合，采用外部直接解析的模式，已成功地檢測一系列有機化合物[22-23]。本文通過采用MPT-MS實驗平臺對大米中黃曲霉毒素B1進行檢測，并利用黃曲霉毒素B1的碎片離子m/z285作定量分析，可快速測定大米中黃曲霉毒素B1的含量，且在半定量意義下數據可靠。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

LTQ-XL型線性離子阱質譜儀(美國Finnigan公司，配備有Xcalibur數據處理系統)；微波等離子體炬管，WGY-20微波功率源(均由吉林大學于愛民教授課題組提供)；超純水儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 材料與試劑

黃花黏米、奉新發米、泰太香油黏米、皇陽貢米購于南昌市旺中旺超市；龍南大米購于江西贛州龍南縣；柳河大米購于吉林柳河縣。

黃曲霉毒素B1(10 mg，上海百靈威化學技術有限公司)；甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；用甲醇-去離子水(體積比1∶1)的混合溶液，將10 mg黃曲霉毒素B1 溶解于100 mL容量瓶中，制得100 mg/L儲備液。

1.3 實驗條件

LTQ-MS為正離子檢測模式，離子傳輸管溫度150 ℃，質譜掃描范圍為m/z100～500，其它參數LTQ-MS自動優化；微波等離子體炬(MPT)離子源；MPT的載氣(Ar)流量400 mL/min，維持氣(Ar)流量600 mL/min，微波功率為50 W(其可調范圍30～200 W)。固定炬焰離質譜口距(d)約12 mm，炬焰離液面高3 mm，炬管與水平面成30°。

1.4 實驗方法

微波等離子體炬(MPT)直接分析液體樣品的原理如圖1所示[21]，采用外部進樣的方式，與以往采用的中心管道進樣方式有所不同[24-26]。中心管道進樣時，需要輔以去溶裝置，樣品形成干燥的氣溶膠后從MPT中心管道引入等離子體，以使充分吸收微波能量，形成的離子導入質譜儀中檢測。這種方式適合分析水樣中的金屬元素，但不適合分析有機樣品，因為有機分子在等離子體中易分解，得不到樣品的原始信息。然而，外部進樣可通過固定炬焰與有機樣品間的距離，MPT炬管與水平面固定成30°角架置，炬焰尖端離質譜口約12 mm，炬焰略高于溶液液面3 mm。通過MPT炬焰外層對裝在表面皿中的樣品萃取液進行解析，能得到有機樣品中黃曲霉毒素B1的指紋譜圖，而且經該方式產生的待測物離子可由質譜儀進行檢測。

配制一系列濃度梯度的標準品，通過表面燒蝕進樣，獲得特征質譜圖。以AFB1的二級質譜信號(m/z285)作為定量依據繪制工作曲線，再對大米樣品進行檢測。將所得質譜數據導出至Excel中進行分析。

2 結果與討論

2.1 MPT離子化技術

MPT源是一種可用于現場直接質譜分析的新型離子化技術，對中性復雜基質樣品能進行較好的解析。為避免樣品污染或質譜儀損傷，采用甲醇-去離子水(1∶1)[27]對大米進行萃取，再通過MPT表面燒蝕大米萃取液，形成的待測離子進入質譜儀器進行檢測。該方法具有分析檢測復雜樣品的能力，降低了對樣品預處理的要求；串聯質譜分析結果給出了較豐富的離子結構信息。與以往內管進樣分析液態樣品的方式不同，MPT第一次以表面解析的方式分析有機液體樣品，且對有機液體樣品能進行較好的解吸，獲得清晰的樣品指紋譜圖。由于MPT裝置操作簡單，易集成和小型化，通過與小型質譜儀器的耦合能運用于復雜基質樣品的現場分析。

2.2 黃曲霉毒素B1的一級質譜與二級質譜分析

MPT是一種軟電離技術，一般經質子化、去質子化或與其它基團結合后形成待測物離子。通過MPT對溶液表面燒蝕發現，正離子模式下得到黃曲霉毒素B1的信號。從分子結構上看，黃曲霉毒素B1易形成質子化的分子離子[M+H]+(m/z313)(如圖2A)，這是由于黃曲霉毒素B1中氧原子電負性比碳原子大，質子易與其中的氧原子結合得到m/z313離子峰，再對母離子m/z313進行串聯質譜分析。從串聯質譜(圖2B)可以看出，大部分母離子(m/z313)失去中性碎片CO或C2H4得到m/z285，而少部分母離子丟失醚鍵后得到基峰m/z269，這些碎片離子(如圖2B)與文獻研究結果一致[28-29]。

2.3 實驗條件的優化

通常在MPT質譜儀工作中，載氣流量、維持氣流量及微波功率均會對離子信號強度有較大的影響。為了利用m/z285的信號作定量測量，需研究檢測m/z285的最佳條件。圖3A顯示了載氣流量與信號強度的關系，載氣流量在200～400 mL/min范圍內與信號強度呈正相關，當超過400 mL/min時，信號逐漸減弱，這可能是由于氣體流速過大而導致等離子體焰炬不穩定所致，因此選擇最佳載氣流量為400 mL/min。如圖3B所示，維持氣的最優條件為600 mL/min。本實驗嘗試調節微波功率源來控制等離子體焰炬能量的大小，從而得到樣品最佳的離子化焰炬。結果顯示，微波能量在30～50 W范圍內時，等離子體焰炬使樣品離子化的效果逐漸上升，當微波能量大于50 W時，微波等離子體炬的焰炬能量過高，使得AFB1在高溫等離子的作用下碎裂程度更加劇烈，難以得到m/z285的質譜信號。實驗選擇最佳微波功率為50 W。

2.4 大米中AFB1的快速MPT-質譜法檢測

MPT對大米萃取液進行表面燒蝕，可以看到特征離子峰m/z313豐度較低(如圖4A)。為了排除假陽性信號，需對大米萃取液的指紋譜中m/z313離子峰進行串聯質譜研究。選取母離子為m/z313，獲得二級質譜(如圖4B)。在串聯質譜中可以看出，通過母離子(m/z313)進行碰撞誘導解離產生的碎片離子(m/z285，m/z269)與標準品黃曲霉毒素B1的碎片離子吻合，可以確認該大米已發生霉變。該方法操作簡單，每種大米的檢測可在0.5～1 min內完成。因此，這種微波等離子體炬質譜檢測方法快速、靈敏、準確，且MPT質譜儀成本低、操作簡易，適于發展成為現場分析儀器，用于食品質量方面的實時在線監控。

在優化條件下利用串聯質譜信號m/z285，可對大米中黃曲霉毒素B1的含量做定量分析。在大米萃取液中通過標準加入法，配成一系列濃度梯度的黃曲霉毒素B1標準溶液，每種濃度測10次，繪制出黃曲霉毒素B1的工作曲線。結果顯示，黃曲霉毒素B1的線性范圍為0.5～20 μg/L，相關系數為0.999 4。根據 LOD=3σc/S(σ為標準偏差，c為標準品濃度，S為相應信號強度的平均值)可計算出此方法的檢出限為0.12 μg/kg。對每個實驗點10次重復實驗數據獲得的相對標準偏差(RSD)為7.1%～12.5%。對實際大米樣品作實測分析，用所得數據由AFB1的工作曲線計算得到樣品中AFB1的含量。結果如表1所示，實際樣品的加標回收率為95.8%～107.2%，10次測量的RSD為2.2%～10.1%，可見該檢測方法在半定量意義下結果可靠。

SampleOriginal(ng/L)Added(ng/L)Found(ng/L)RSD(%)Recovery(%)Huanghuastickyrice(黃花黏米)52485001003524958LongnanCountryrice(龍南大米)5376500106781011060Liuherice(柳河大米)5012500942538940Thaitoosesameoilstickyrice(泰太香油黏米)-5005026451005HuangyangKongmy(皇陽貢米)586050011221221072

-:no detected

2.5 主成分分析

為了更清晰地區分大米是否霉變，采用Matlab軟件中“Princomp”函數對霉變前后大米的質譜數據進行PCA分析，圖5表明霉變前密封的大米(正常大米)與霉變后的大米(霉變大米)可以較好地區分開。在大米霉變前后的三維PCA得分圖(圖5A)中，PC1，PC2和PC3的貢獻率分別為62.5%，20.9%和5.4%，三者總和88.8%，該結果進一步說明，久置霉變大米的化學成分與正常大米存在較大差異。根據PCA相應的載荷圖(圖5B)可以看出，對三維PCA得分圖貢獻較大的m/z范圍在250～320之間。而且在PC1方向上區分較好，其貢獻較大的質譜信號為m/z269和285。同時，在PC2和PC3的載荷分布圖(圖5B)也清晰地顯示特征峰m/z269，257，298和313等對區分霉變前后大米的貢獻較大，說明這些物質在霉變前后大米中的含量存在較大差異。研究表明，MPT-MS可在分子水平上快速區分大米質量的好壞，同時為糧油、動植物等食品的質量分析提供了一種快速分析的途徑。

3 結 論

本文建立了無需樣品預處理或是少量樣品預處理的條件下，可直接檢測大米樣品中黃曲霉毒素B1含量的分析方法。以MPT作為線性離子阱質譜儀的離子源，通過用MPT表面燒蝕的進樣方式，結合PCA分析，能在痕量水平檢測大米中黃曲霉毒素B1的總含量，并快速區分大米是否霉變；這種新型等離子體質譜(MPT-LTQ-MS)的整體設備搭建簡單，檢測速度快，靈敏度高，有望發展成為一種便攜式分析儀，在食品質量監控方面具有一定的應用潛力。

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Direct Analysis of Aflatoxin B1 in Rice by Microwave Plasma Torch Mass Spectrometry

JIANG Tao1，LI Yun1，ZHAO Xiao-jing1，XIAO Sai-jin1，YANG Shui-ping1，ZHU Zhi-qiang2*

(1.Jiangxi Key Laboratory for Mass Spectrometry and Instrumentation，East China Institute of Technology，Nanchang 330013，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，Shangrao Normal University，Shangrao 334001,China)

A novel and simple mass spectrometric method based on microwave plasma torch(MPT) was developed for the rapid detection of aflatoxin B1(AFB1) in rice without sample pretreatment.The MPT mass spectra of AFB1 were obtained,and the quantitative analysis mainly was based on the characteristic fragments of AFB1(m/z285).The results showed that there was a good linear relationship in the concentration range of 0.5-20 μg/L with correlation coefficient(r2) of 0.999 4，and the evaluated limit of detection(LOD) was 0.12 μg/kg.The direct detection of AFB1 in some kinds of rice were conducted，with recoveries of 95.8%-107.2% and relative standard deviations(RSD，n=9) of 2.2%-10.1%.With the help of principle component analysis(PCA)，the moldy rice and normal rice could be rapidly distinguished.With the advantages of rapidness and high sensitivity，the MPT-MS is a powerful tool for the high-throughput detection of moldy rice,and also shows a great potential in the monitoring of cereal and oil，animal，plant food，etc.

microwave plasma torch(MPT)；mass spectrometry；aflatoxin B1(AFB1)；rice

2016-03-09；

2016-06-23

國家科技部項目國家重大儀器專項(2011YQ14015009)；國家自然科學基金(21565003)；江西省科技支撐項目(2014BBG70091)；東華理工大學2011質譜科學與儀器協同創新中心及東華理工大學朱志強博士科研啟動基金

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.010

O657.6；S852.44

A

1004-4957(2016)12-1575-06

*通訊作者：朱志強，博士，副教授，研究方向：質譜分析，Tel：0791-83896370，E-mail:zhiqiangz@iccas.ac.cn