固相萃取-氣相色譜法檢測血清中有機氯農藥殘留的研究

段麗村，周建于，李佳欣，李鵬飛，徐 芳，王 琦

(昆明醫科大學 公共衛生學院，云南 昆明 650500)

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固相萃取-氣相色譜法檢測血清中有機氯農藥殘留的研究

段麗村，周建于，李佳欣，李鵬飛，徐 芳，王 琦*

(昆明醫科大學 公共衛生學院，云南 昆明 650500)

建立了血清中DDTs和BHCs共8種有機氯農藥殘留的固相萃取-氣相色譜檢測方法。樣品經超聲酸化沉淀蛋白后，采用正己烷-丙酮(9∶1)經Cleanert ODS C18N固相萃取小柱提取，Florisil固相萃取小柱凈化，氮氣吹干，以500 μL正己烷定容，氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)進行定量分析。結果表明，方法的線性范圍2～200 ng/mL，相關系數(r)為0.996 4～0.999 0，檢出限(LOD) 為0.1～0.9 ng/mL，定量下限(LOQ)為0.4～3.0 ng/mL。8種農藥的回收率為80.5%～112.7%，相對標準偏差(RSD)為2.1%～7.9%。該方法具有較高的準確度和精密度，適用于血清樣品中痕量有機氯農藥的檢測。

血清；DDTs；BHCs；有機氯農藥；固相萃取；氣相色譜

有機氯農藥(OCPs) 具有高效、低成本、廣譜殺蟲等特點，在我國20世紀50年代之后大量使用。因其污染嚴重，在環境中的長期殘留性、生物蓄積性和高毒性等特征[1]，我國于1983年停產使用六六六、滴滴涕，但在很多曾施用有機氯農藥的地方仍有大量殘留[2]。已有研究表明，DDT已進入全球性的生物地球化學循環，成為世界各國關注的環境和健康問題[3]。截至2009年，已有約十余種有機氯農藥被《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》列為典型的持久性污染物(Persistent organic pollutants，POPs)及優先控制有機污染物加以控制[4-5]。

有機氯及其代謝產物的化學性質穩定、脂溶性強、難降解，目前在環境和生物樣品中仍然可以檢測到有機氯農藥[6-7]。該類化合物可通過消化道、呼吸道和皮膚吸收，分布到各組織和器官，在血液中幾乎全部與血漿蛋白結合[8-9]。因此，對生物樣品中有機氯農藥進行分析檢測是了解其在生物體內暴露的基礎。對于一般人群的暴露研究，血液是較易獲得的樣本。由于有機氯及其代謝產物在人體血液中的含量大致與其接觸量成正比關系,因此，檢測人體血液中的有機氯含量可以反映人群暴露于污染物的水平。

血清中有機氯農藥殘留的分析，國外通常采用固相萃取法進行提取和凈化，GC-MS檢測，且常與其它鹵代有機物如多氯聯苯(PCBs)、多溴聯苯醚(PBDEs)等同時檢測[10]；而六六六(Hexachlorocyclohexane，BHC) 和DDT(Dichlorodiphenyltrichloroethane) 的測定大多采用電子捕獲檢測器檢測的氣相色譜法，國內對該方面的研究較少，一般用液液萃取提取待測物，再用濃硫酸或濃硫酸與Florisil柱聯用凈化，氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)分析定量[11]。電子捕獲檢測器雖在定性能力上弱于質譜，但對于有機氯的檢測靈敏度與MS相當，也是分析含氯化合物的常用檢測器。本研究以人血清中BHC 4種異構體和DDT及其主要代謝產物為研究對象，建立了一種快速、準確、靈敏的檢測方法，為人群有機氯暴露水平調查以及評價有機氯農藥污染與人群健康的關系提供了可靠的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀配電子捕獲檢測器(ECD，Varian CP-3800美國瓦里安公司)；Rtx-5毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Restek公司)；DG-12D固相萃取裝置(12孔，上海皓莊儀器有限公司)；WH-1微型渦旋混合儀(上海瀘西分析儀器廠)；KQ3200超聲波清洗儀(科橋超聲波設備有限公司)；氮吹儀(上海濟成分析儀器公司)。

α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC，p,p′-DDE，p,p′-DDD，o,p′-DDT，p,p′-DDT 8種農藥標準品(農業部環境保護科研監測所)；甲醇、二氯甲烷、甲酸(分析純，北京化學試劑廠)；無水硫酸鈉(分析純，天津化學試劑廠)；正己烷(色譜純，德國Merk公司)；高純N2(純度>99.999%，昆明梅塞爾氣體有限公司)；ODS C18N柱、Florisil柱(均為500 mg/3 mL，天津博納艾杰爾公司)；Silica柱(500 mg/3 mL，北京迪馬科技有限公司)。

1.2 溶液的配制

8種有機氯農藥標準品的初始濃度為100 μg/mL，用正己烷配成10 μg/mL的混標儲備液，使用前稀釋至1.00 μg/mL，貯存于4 ℃冰箱。無水硫酸鈉使用前在馬弗爐中450 ℃灼燒4 h。

1.3 色譜條件

進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度310 ℃，載氣為高純氮氣，流速1 mL/min，尾吹30 mL/min，不分流模式進樣量1 μL。毛細管色譜柱升溫程序：100 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以 4 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，共26.5 min。

1.4 樣品采集與制備

選取昆明市呈貢區雨花村和烏龍村50～70歲男性居民，抽取空腹靜脈血，靜置30 min，3 500 r/min離心10 min，取上層血清，放入-80 ℃冰箱保存備用。預實驗選用混合血清進行。

1.5 樣品前處理過程

1.5.1 沉淀蛋白 血清樣品室溫解凍，取1 mL于10 mL離心管中，加純水1 mL，渦旋2 min混勻，加入甲酸0.5 mL并渦旋2 min，超聲20 min酸化沉淀蛋白。

1.5.2 提 取 Cleanert ODS C18N固相萃取小柱的活化過程：先用5 mL二氯甲烷淋洗，再加入8 mL甲醇淋洗，8 mL純水平衡，保持小柱不干。將沉淀蛋白質的血清樣品加入活化好的C18柱，用10 mL純水沖洗去除雜質，抽干柱中水分并在空氣中晾干30 min，待測物用10 mL正己烷-丙酮(9∶1)洗脫，控制流速為1～2 mL/min。

1.5.3 凈 化 將10 mL正己烷-丙酮(9∶1)洗脫液用氮氣吹干至3 mL，過裝有2 g無水Na2SO4的小漏斗并用1 mL正己烷沖洗。Florisil固相萃取小柱活化：加入8 mL正己烷-丙酮(9∶1)溶液沖洗柱子，保持小柱不干，將上述脫水的溶液加入已活化的小柱，收集流出液，并用6 mL正己烷-丙酮(9∶1)溶液淋洗小柱，合并濾液后，氮氣吹干溶液，用500 μL正己烷溶解，過0.45 μm濾膜，待GC檢測。

1.6 二甲基氯硅烷(DMCs)對襯管硅烷化處理

采用丙酮等有機溶劑將襯管清洗干凈、晾干后，用5% DMCs正己烷溶液浸泡過夜，取出用甲醇清洗2～3次，浸泡1 h后，取出晾干，干燥條件下保存備用。

2 結果與討論

本研究選取不含目標待測物的混合血清樣品，每1 mL樣品加入25 μL濃度為1 μg/mL的8種有機氯農藥混標，重復3次，優化樣品前處理條件。

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇 有機氯農藥屬于弱極性至中等極性的化合物，本實驗采用中等極性的Rtx-1701和Rtx-5兩種毛細管色譜柱對待測物進行分離，發現在不同色譜條件下，兩種色譜柱均能較好地分離8種待測有機氯農藥。根據實驗室現有條件，采用Rtx-5色譜柱進行分離。

2.1.2 載氣流速的選擇 載氣流量是影響待測物在色譜柱中分離效率的重要因素，載氣流量慢，各峰的分離度較好，但所用分析時間長；載氣流量較快，分析時間縮短，但分離度變差。實驗考察了柱流量為1 mL/min和2 mL/min 對分離效果的影響，發現柱流量增大時，各待測物的保留時間提前，但o,p′-DDT與p,p′-DDD部分色譜峰重疊，不能達到完全分離。故選擇柱流量為1 mL/min，在該柱流量下，各待測物分離效果好。

2.1.3 襯管硅烷化處理 由于p,p′-DDT可能會在進樣口分解為p,p′-DDE和p,p′-DDD，所以參照美國EPA8081B方法，檢測了一定數量的樣品后，按“1.6”方法對氣相色譜進樣口襯管進行清洗和硅烷化處理，更換進樣墊，并將毛細管色譜柱連接進樣口的一端截除一段。

2.2 沉淀蛋白

人血清中含有的脂肪酸、膽固醇、甘油三脂和蛋白質易附著在色譜柱上，從而改變柱子的特性并降低柱壽命，同時其中的游離脂肪酸可能會干擾色譜測定。根據文獻報道，甲酸是沉淀這些脂質和蛋白質的良好沉淀劑,故實驗采用甲酸作為沉淀劑。分別取1 mL血清，各加入甲酸0.2，0.5，1 mL沉淀蛋白，按操作步驟進行處理和檢測，發現加入甲酸0.5 mL和1 mL時，雜峰明顯減少，且效果相當，所以本實驗選擇加入0.5 mL甲酸沉淀血清中的蛋白質。

2.3 提取條件的優化

2.3.1 固相萃取柱的選擇 固相萃取是近年用于液體樣品前處理的新技術。當液體中有機化合物通過合適的固相萃取柱時被富集,再用少量選擇性溶劑洗脫，因而固相萃取是同時完成萃取和濃縮有機污染物的有效方式[12-14]。該方法操作簡單、流程短，同時有機溶劑的用量較少，符合快速、高效、低污染的樣品前處理方法[14]。因此本實驗選擇固相萃取法對血清中有機氯農藥進行提取。

C18材料的作用基團是十八烷基，對非極性、弱極性和中等極性化合物具有廣泛保留，是目前固相萃取中應用最廣的吸附劑。C18-N是硅膠鍵合C18后未進行封端處理的反相柱，作用基團為十八烷基和硅羥基，對極性化合物的保留增強。根據待測物的理化性質和樣品基質的特點，選擇對待測物有較強保留能力的C18反相填料作為固定相進行萃取。

2.3.2 洗脫溶劑的選擇 由于有機氯農藥屬于弱極性至中等極性的化合物，實驗考察了正己烷、正己烷-二氯甲烷(9∶1)、正己烷-丙酮(9∶1) 3種溶劑體系對待測物的洗脫效果。各取純水1 mL，按樣品前處理步驟，沉淀蛋白，過C18柱，分別用上述3種溶劑15 mL對待測農藥進行淋洗。結果顯示，正己烷、正己烷-丙酮(9∶1)作為洗脫溶劑時8種有機氯農藥的回收率相對較高。

進一步考察了洗脫溶劑正己烷及正己烷-丙酮(9∶1)用量的影響。用12 mL該溶劑進行淋洗，每收集2 mL作為1份，進行洗脫曲線的制作。結果顯示，以正己烷作為洗脫溶劑時，需加入15 mL才能將δ-BHC洗脫完全，而正己烷-丙酮(9∶1)只需10 mL則可將8種目標農藥洗脫完全，所以實驗采用10 mL正己烷-丙酮(9∶1)作為最佳洗脫溶劑。

2.4 凈化條件的優化

2.4.1 固相萃取柱的選擇 采用“1.5”方法分別對Florisil柱和Si柱進行活化，上樣，收集流出液，采用正己烷、正己烷-丙酮(9∶1)、正己烷-二氯甲烷(1∶1)各20 mL進行淋洗，過0.45 μm濾膜，GC檢測。結果表明，采用正己烷-丙酮(9∶1)作為洗脫溶劑，Florisil柱與Si柱的凈化效果相當，但Si柱凈化后雜峰相對較多，考慮到后續將對多個血清樣品進行檢測，本實驗采用Florisil柱對血清樣品進行凈化。

2.4.2 洗脫溶劑體積的選擇 用Florisil柱凈化，正己烷-丙酮(9∶1)為洗脫溶劑，對洗脫所需體積進行考察。用6 mL該溶劑進行淋洗，每收集1 mL作為1份，共6份進行洗脫曲線的制作。結果顯示，前5 mL洗脫液可以洗脫大部分農藥，為確保待測物洗脫完全，實驗選擇正己烷-丙酮(9∶1)的最佳用量為6 mL，且采用的流速為小柱自然流速，以便洗脫液與待測物充分接觸。

2.5 方法評價

2.5.1 線性范圍、檢出限及定量下限 配制不同濃度梯度的混合標準溶液，在最佳色譜條件下，以峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度為橫坐標(X,ng/mL)制作標準曲線，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)計算檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結果如表1所示，方法的線性范圍2～200 ng/mL，相關系數(r)為0.996 4～0.999 0，LOD為0.1～0.9 ng/mL，LOQ為0.4～3.0 ng/mL。

表1 方法的特征參數

2.5.2 回收率與精密度 在空白血清樣品中分別加入5，20 ng/mL兩個濃度梯度的有機氯標準品，在最佳條件下進行樣品前處理和檢測。結果如表2所示，8種農藥的回收率為80.5%～112.7%，相對標準偏差(RSD)為2.1%～7.9%。所建立的方法具有較高的準確度和精密度，能用于血清樣品中痕量有機氯農藥的分析檢測。

表2 血清樣品的加標回收率與相對標準偏差(n=5)

2.5.3 實際樣品的分析 將建立的方法用于調查對象血清中8種有機氯農藥的檢測，圖1為5 ng/mL標準溶液和第56號樣品的色譜圖。對于標準溶液，8種有機氯農藥的保留時間見表1。實際樣品中檢出4種有機氯農藥，其中α-BHC為1.87 ng/mL，p,p′-DDE為2.86 ng/mL，p,p′-DDD為2.48 ng/mL，o,p′-DDT為2.60 ng/mL。實驗結果表明，利用C18和Florisil固相萃取柱分別對樣品進行提取和凈化，正己烷-丙酮(9∶1)溶劑對待測物進行洗脫后，8種有機氯農藥的精密度和回收率均較為理想。該方法快速、高效，能夠滿足血清中有機氯農藥殘留檢測的要求。

圖1 有機氯農藥標準溶液(A，5 ng/mL)及血清樣品(B)的色譜圖

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Determination of Organochlorine Pesticide Residues in Serum by Solid Phase Extraction and Gas Chromatography

DUAN Li-cun，ZHOU Jian-yu，LI Jia-xin，LI Peng-fei，XU Fang，WANG Qi*

(School of Public Health,Kunming Medical University,Kunming 650500,China)

A method was developed for the determination of eight kinds of organochlorine pesticides，including DDTs and BHCs etc. in serum by solid-phase extraction(SPE) and gas chromatography(GC).The samples were treated by ultrasonic precipitation，cleaned on a Cleanert ODS C18N solid phase extraction column with hexane and acetone(9∶1) and purified on a Florisil solid phase extraction column.Then，the samples were blew with nitrogen until the test tubes were dry，and resolved with N-hexane.The targeted compounds were analyzed by GC with electron capture detector(ECD) .The calibration curves were linear in the range of 2-200 ng/mL，with correlation coefficients(r) of 0.996 4-0.999 0.The limits of detection(LOD) were in the range of 0.1-0.9 ng/mL，and the limits of quantitation(LOQ) were in the range of 0.4-3.0 ng/mL.The results showed that the spiked recoveries were in the range of 80.5%-112.7% with relative standard deviations(RSD)of 2.1%-7.9%.The method has high accuracy and precision，and could be used for the analysis of trace organochlorine pesticides in serum samples.

serum;DDTs;BHCs;organochlorine pesticides;solid-phase extraction(SPE);gas chromatography(GC)

2016-04-12；

2016-06-28

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.016

O657.71;F767.2

A

1004-4957(2016)12-1606-05

*通訊作者：王 琦，博士，副教授，研究方向：營養與食品衛生學，Tel：0871-65922924，E-mail：lwangqi@163.com