超高效液相色譜-質譜聯用法測定草莓中鞣花酸

楊 媛，石 磊，楊軍軍，張瑩瑩，張開春,3*

(1.北京市農林科學院 林業果樹研究所，北京 100093；2.農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100097；3.北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100093)

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超高效液相色譜-質譜聯用法測定草莓中鞣花酸

楊 媛1,2，石 磊1，楊軍軍1，張瑩瑩1，張開春1,3*

(1.北京市農林科學院 林業果樹研究所，北京 100093；2.農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100097；3.北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100093)

建立了測定草莓中鞣花酸含量(包括游離鞣花酸和總鞣花酸)的超高效液相色譜-質譜聯用(UPLC-MS/MS)分析方法。草莓中游離鞣花酸在酸性條件下用甲醇提取，經C18分散固相萃取凈化后可直接測定；總鞣花酸經酸性水解呈游離態再經分散固相萃取凈化后進行測定。凈化液經C18色譜柱分離，以甲醇和0.5%甲酸水為流動相進行梯度洗脫，電噴霧負離子(ESI-)模式電離，超高效液相色譜-質譜法(UPLC-MS/MS)測定，外標法定量。結果表明：在10～500 ng/mL濃度范圍內鞣花酸的線性關系良好，相關系數為0.998 1，游離鞣花酸的定量下限為0.5 mg/kg，總鞣花酸的定量下限為5.0 mg/kg。在低、中、高3個加標濃度的回收實驗中，游離鞣花酸的加標回收率為86.7%～113.6%，相對標準偏差均小于10%。該方法操作簡單，靈敏度高，準確性好，適用于草莓中鞣花酸的測定。

超高效液相色譜-質譜聯用法(UPLC-MS/MS)；游離鞣花酸；總鞣花酸；草莓

近年來，鞣花酸因其突出的抗氧化效果備受關注。有報道表明，鞣花酸廣泛存在于山莓[1]、草莓[2]、藍莓[3]、紅醋栗[4]、石榴[5]、胡桃[6]等水果和堅果中。鞣花酸具有重要的抗菌[7]、抗炎[8]、抗氧化[9-12]、促進傷口愈合[4]、心肌保護[13]、鎮痛[14]、腫瘤抑制[1,15]等功能，對癲癇病[16]、糖尿病及其并發癥[17]、動脈硬化[18]、癌癥[19-21]等疾病的預防和治療效果備受關注，鞣花酸具有比維生素E更強的抗氧化脅迫作用[22]。

鞣花酸存在3種形式[1]:即與糖結合成醚的鞣花單寧，鞣花酸糖苷，以及少量的游離鞣花酸。目前，鞣花酸含量的分析方法有高效液相色譜法[23-24]、反滴定法[25]、紫外分光光度法[4,26]、薄層層析法[27-28]、高效毛細管電泳法[29]等，但國內鮮有關于超高效液相色譜-質譜聯用法(UPLC-MS/MS)檢測鞣花酸的報道。在鞣花酸測定的多種方法中，反滴定法的操作比較繁瑣、費時費力且溶劑用量大；分光光度法前處理采用萃取法比較繁瑣，且雜質干擾影響測定結果；薄層層析法主要用于定性分析；高效毛細管電泳法前處理復雜、耗時長、溶劑用量大；高效液相色譜法是目前效率較高、定性定量準確性好的一種檢測方法。而相比之下，超高效液相色譜-質譜聯用法具有效率更高，溶劑試劑用量更少，定性、定量更準確的優勢。

本研究針對富含鞣花酸的代表性水果草莓[30]，建立了分散固相萃取凈化、超高效液相色譜-質譜聯用法測定草莓中游離鞣花酸和總鞣花酸，該方法操作簡便，準確性高，可用于其他水果中游離鞣花酸和總鞣花酸含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-S(Acquity UPLC，ZspraYTM，ESI/APCI/ESCi?，Waters公司)；乙腈、甲醇(色譜純，Merck公司)，三氟乙酸(分析純，北京北化精細化學品有限責任公司)，鞣花酸(純度98.5%，Dr.Ehrenstorferg公司)，C18填料(Dikma公司)。除非另有說明，其他所用試劑均為分析純試劑；實驗用水為GB/T6682規定的一級水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 游離鞣花酸 準確稱取1.00 g草莓勻漿樣品置于50 mL具塞刻度離心管中，加入甲醇-0.1%三氟乙酸水(80∶20)提取液定容至50 mL，渦旋混勻3 min，10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液加入20 mg C18粉末，渦旋振蕩3 min，5 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm有機濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。

1.2.2 總鞣花酸 稱取1.00 g 草莓勻漿樣品置于50 mL刻度離心管中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液定容至50 mL，渦旋振蕩3 min，置于90 ℃水浴中加熱2 h。冷卻后10 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液置于10 mL刻度離心管中，加入甲醇定容至10 mL，渦旋振蕩2 min。取2 mL上清液加入20 mg C18粉末，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min。取1.0 mL清液，過0.22 μm有機相濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。

1.3 標準溶液配制

鞣花酸標準儲備液濃度為1.0 mg/mL的乙腈溶液，避光存儲于4 ℃冰箱，用甲醇逐級稀釋為500，250，100，50，25，10 ng/mL的標準工作溶液，使用前需新鮮配制。

1.4 檢測條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH?C18(2.1×50 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A為甲醇，B為0.5%甲酸水溶液；流速：0.2 mL/min；進樣量：1.0 μL。梯度洗脫程序：0～2.5 min，90%B；2.5～3 min，90%～10%B；3～5 min，10%B；5～5.5 min，10%～90%B；5.5～8 min，90%B。

1.4.2 質譜條件 掃描模式：電噴霧負離子模式ESI(-)；毛細管電壓：2 500 V；干燥氣流量：氮氣 500 L/H；去溶劑化溫度：350 ℃；霧化器壓力：7.0 bar；碰撞氣：氬氣；監測方式：多反應監測(MRM)；定量離子對300.97>144.70，錐孔電壓82 V，碰撞電壓38 V；定性離子對300.97>228.71，錐孔電壓82 V，碰撞電壓28 V。

圖1 50 ng/mL鞣花酸的典型色譜質譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 50 ng/mL ellagic acid

圖2 鞣花酸的二級質譜圖Fig.2 MRM spectrum of ellagic acid collision energy：38 eV

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

本研究采用UPLC-MS/MS技術進行檢測，由于二級質譜的多反應離子監測模式與一級質譜的單離子監測方式相比專屬性更高，抗背景干擾能力更強，定量的準確性更好，檢出限更低，因此本文以多反應離子監測模式檢測鞣花酸；掃描方式的選擇主要依據物質本身的結構特點，鞣花酸作為有機酸易失去1個質子帶負電荷，理論上鞣花酸可采用負離子進行掃描。研究證實，在含有甲酸的流動相系統中，采用負離子方式掃描時鞣花酸的響應較高，峰形較尖銳，因此，本研究選擇多反應離子監測模式負離子掃描方式檢測鞣花酸(見圖1)。

2.2 裂分途徑

圖2為碰撞電壓為38 eV條件下，鞣花酸的二級質譜圖。根據鞣花酸的分子結構特點和碎片質荷比，推測鞣花酸在該質譜條件下的裂分途徑如圖3所示。由圖3可見，鞣花酸(化合物(1))是含有4個羥基的對稱雙內酯，在負離子模式下，容易失去1個氫離子帶上負電荷而形成較穩定的分子離子即(2)，該離子由于分子的良好對稱性和苯環的π鍵共軛作用而能穩定存在。鞣花酸有3個響應較高的碎片離子，其中，m/z=283.82是分子離子丟失水分子的產物即(3)。m/z=228.71是(3)丟失兩分子CO的產物即(4)；m/z=144.70是(4)進一步丟失3分子CO的產物即(5)。

圖3 負離子模式下鞣花酸的質譜裂分示意圖Fig.3 Tentative assignment of fragmentation of ellagic acid under negative ion mode

2.3 前處理條件的選擇

2.3.1 游離鞣花酸提取溶劑的選擇 目前國內報道的高效液相色譜法中，鞣花酸的提取多采用丙酮溶液浸泡6～8 h后超聲或回流提取，其操作繁瑣、耗時長，且提取后未經凈化直接使用高效液相色譜儀檢測，易對色譜柱及檢測器造成污染。

鞣花酸屬于酸性物質，本實驗比較了乙腈、甲醇、乙腈-水(80∶20)、甲醇-水(80∶20)、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20)、甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20) 6種提取液對“章姬”樣品中添加5.0 mg/kg鞣花酸的提取效果。結果表明，鞣花酸在后2種溶劑中的提取回收率均大于90%，而在前4種溶劑中的提取回收率均不大于60%，表明后2種溶劑的提取效果較好。但樣品經乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20)提取，C18凈化后，仍含有較多雜質；而經甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20)提取，C18凈化后可有效去除雜質。因此，實驗選擇甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20)作為樣品的最佳提取溶劑。

2.3.2 總鞣花酸水解條件的優化 用“章姬”樣品比較了總鞣花酸在酸性條件(2 mol/L三氟乙酸水溶液)和堿性條件(10 mol/L氫氧化鈉溶液)的水解效果。結果表明，兩種水解方式下總鞣花酸的水解率相當。但堿性水解后，反應溶液還需進行pH值調節和萃取分液等步驟后，才能進行稀釋、上機測定；而酸性水解后，反應液可直接進行稀釋、上機測定。因此，實驗選擇步驟更為簡化的酸性方式將總鞣花酸水解為游離鞣花酸。

2.4 線性范圍與定量下限

在優化色譜條件下，測定了一系列濃度(500，200，100，50，25，10 ng/mL)的鞣花酸標準溶液。分別以定量離子峰面積(Y)對質量濃度(X，ng/mL)進行回歸方程擬合。結果表明，在10～500 ng/mL濃度范圍內，鞣花酸的線性關系良好，線性方程為Y=97.67X+2 396(r=0.998 1 )。該方法的最低定量濃度為10 ng/mL，根據前處理條件，鞣花酸的定量下限為0.5 mg/kg，總鞣花酸(以游離鞣花酸計算)的定量下限為5.0 mg/kg。

2.5 加標回收率及相對標準偏差

選取“紅顏”、“章姬”、“甜查理”3種北京主栽草莓品種為游離鞣花酸加標回收實驗的基質，分別添加0.5，5.0，10 mg/kg游離鞣花酸，每個濃度設3個平行。實驗結果表明，3種代表基質中游離鞣花酸的加標回收率為86.7%～113.6%，相對標準偏差(RSD)為2.1%～9.5%(見表1)。表明方法的精密度和準確度較好，能滿足檢測要求。

表1 草莓中游離鞣花酸的添加回收試驗結果(n=3)

2.6 重現性試驗

平行稱取同一“章姬”勻漿樣品6份，分別置于50 mL具塞刻度離心管中，加入甲醇-0.1%三氟乙酸水(80∶20)提取液定容至50 mL，渦旋混勻3 min，10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液加入20 mg C18粉末，渦旋振蕩3 min，5 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm有機濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。結果表明，該樣品的游離鞣花酸含量為2.30 mg/kg，RSD為2.4%，具有良好的重復性。

平行稱取同一“章姬”勻漿樣品6份，分別置于50 mL刻度離心管中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液定容至50 mL，渦旋振蕩3 min，置于90 ℃水浴中加熱2 h。冷卻后10 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液置于10 mL刻度離心管中，加入甲醇定容至10 mL，渦旋振蕩2 min。取2 mL上清液加入20mg C18粉末，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min。取1.0 mL清液，過0.22 μm有機相濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。結果表明，該樣品的總鞣花酸含量為26.54 mg/kg，RSD為1.3%，具有良好的重復性。

2.7 實際樣品分析

采用本方法對市售8種實際草莓樣品進行分析，結果表明，不同品種草莓中所含的游離鞣花酸含量差別較小，但總鞣花酸含量有所差別(見表2)，但無論是游離鞣花酸還是總鞣花酸，幾種草莓間均不具有顯著性差異，即相互間未達到p<0.05顯著水平。

表2 8種草莓中鞣花酸含量的測定結果(n=2)

Table 2 Content of ellagica acid in eight strawberry samples (n=2)

SampleFreeellagicacid(mg/kg)Totalellagicacid(mg/kg)Benihoppe(紅顏)6806387Tochiotome(章姬)3863758SweetCharlie(甜查理)86112560TianXiang(天香)9849549YanXiang(燕香)5227806ShuXiang(書香)7959943DongXiang(冬香)118310777Toyonoka(豐香)4586855p?value090075

3 結 論

本文建立了超高效液相色譜-質譜聯用法測定草莓中鞣花酸(包括游離鞣花酸和總鞣花酸)，游離鞣花酸在酸性條件下用甲醇提取，經C18分散固相萃取凈化后可直接測定；總鞣花酸經酸性水解成游離態后，再進行分散固相萃取凈化后，上機測定。方法前處理簡單快捷，測定結果穩定、靈敏度高、準確性好，適合于草莓中鞣花酸的測定，同時也可為其他水果中鞣花酸的測定提供參考。

[1] Flores G，Ruiz del Castillo M L.J.FoodCompos.Anal.，2015,39:55-61.

[2] Ghorbanzadeh B，Mansouri M T，Hemmati A A，Naghizadeh B，Mard S A，Rezaie A.Pharmacol.Biochem.Behav.，2014,126:116-121.

[3] Priyadarsini K I，Khopde S M，Kumar S S，Mohan H.J.Agric.FoodChem.，2002,50:2200-2206.

[4] Gopalakrishnan L，Raman N R，Sethuraman S，Krishnan U M.Carbohydr.Polym.，2014,111:215-221.

[5] Buenrostro-Figueroa J，Huerta-Ochoab S，Prado-Barragánb A，Ascacio-Valdésa J，Sepúlvedaa L，Rodrígueza R，Aguilera-Carbóc A，Aguilar C N.ProcessBiochem.，2014,49:1595-1600.

[6] Mansouri M T，Naghizadeh B，Ghorbanzadeh B.Pharmacol.Biochem.Behav.，2014,120:43-49.

[7] Farbood Y，Sarkaki A，Dianat M，Khodadadi A，Haddad M K，Mashhadizadeh S.LifeSci.，2015,124:120-127.

[8] El-Shitany N A，El-Bastawissy E A，El-desoky K.Int.Immunopharmacol.，2014,19:290-299.

[9] Lee W J，Ou H C，Hsu W C，Chou M M，Tseng J J，Hsu S L，Tsai K L，Sheu W H.J.Vasc.Surg.，2010,52(5):1290-1300.

[10] Qiu Z，Zhou B，Jin L，Yu H，Liu L，Liu Y，Qin C，Xie S，Zhu F.FoodChem.Toxicol.，2013,59:428-437.

[11] Vattem D A，Shetty K.ProcessBiochem.，2003,39(3):367-379.

[12] Fukuda T，Ito H，Yoshida T.Phytochemistry，2003,63(7):795-801.

[13] Warpe V S，Mali V R，Arulmozhi S，Bodhankar S L,Mahadik K R.J.AcuteMed.，2015,5:1-8.

[14] Mansouri M T，Naghizadeh B，Ghorbanzadeh B.Pharmacol.Rep.，2015,67:473-477.

[15] Losso J N，Bansode R R，Trappey A，Bawadi H A，Truax R.J.Nutr.Biochem.，2004,15:672-678.

[16] Dhingra D，Jangra A.J.Funct.Foods，2014,10:364-369.

[17] Akileshwari C，Raghu G，Muthenna P，Mueller N H，Suryanaryana P，Petrash J M，Reddy G B.J.Funct.Foods，2014,6:374-383.

[18] Elhemely M A，Omar H A，Ain-Shoka A A，Abd El-Latif H A，Abo-Youssef A M，El Sherbiny G A.Beni-suefUniv.J.BasicAppl.Sci.，2014,3:239-246.

[19] Munagala R，Aqil F，Vadhanam M V，Gupta R C.CancerLett.，2013,339:175-184.

[20] Mertens-Talcott S U，Talcott S T，Percival S S.J.Nutr.，2003,133:2669-2674.

[21] Notka F，Meier G，Wagner R.AntiviralRes.，2004,64:93-102.

[22] Hassonna E A，Walter A C，Alsharif N Z，Stohs S J.Toxicology，1997，124:27-37.

[23] Nankar R P，Doble M.J.Funct.Foods，2015,15:1-10.

[24] Yang Y，Shi L，Zhang J，Li W S，Zhang K C，Feng X Y.NorthernHorticulture(楊媛，石磊，張佳，李文生，張開春，馮曉元.北方園藝)，2012,15:25-27.

[25] Zhang Q.J.NorthwestUniv.:Nat.Sci.Ed.(張強.西北大學學報:自然科學版)，1997，27(4):313-315.

[26] Chen J H，Wu D M，Wang Y M，Wu Z S.BiomassChem.Eng.(陳笳鴻，吳冬梅，汪詠梅，吳在嵩.生物質化學工程)，2007,41(3):18-20.

[27] Lin T Y，Vine R P.J.FoodSci.，1990，55(6):1607-1609.

[28] Avachat A M，Patel V G.SaudiPharm.J.，2015,23:276-289.

[29] Zhou B H，Wu Z H，Li X J，Liu C，Zhang J.Chin.Pharm.(周本宏，吳振華，李小軍，劉春，張杰.中國藥房)，2005,16(24):1893-1894.

[30] Zheng Y L，Wang S Y，Wang C Y，Zheng W.LWT-FoodSci.Technol.，2007,40:49-57.

Determination of Ellagic Acid in Strawberry by UPLC-MS/MS

YANG Yuan1,2，SHI Lei1，YANG Jun-jun1，ZHANG Ying-ying1，ZHANG Kai-chun1,3*

(1.Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100093，China;2.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(North China)，Ministry of Agriculture，China，Beijing 100097，China;3.Beijing Engineering Research Center for Deciduous Fruit Trees，Beijing 100093，China)

A method was developed for the determination of ellagic acid(free ellagic acid and total ellagic acid) in strawberry by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).In this work，the free ellagic acid was extracted from strawberry with 0.1%trifloroacetric acid-methane，purified by C18dispersive solid-phase extraction，and determined by UPLC-MS/MS.Total ellagic acid was hydrolyzed to free ellagic acid with 2 mol/L trifloroacetric acid aqueous，then purified with C18dispersive solid-phase extraction column，and determined by UPLC-MS/MS.Sample solution was separated on a C18column by gradient elution using methanol-0.5%formic acid aqueous as mobile phase.The linear range of 10-500 ng/mL for ellagic acid was obtained，with correlation coefficient of 0.998 1.The limit of quantitation was 0.5 mg/kg for free ellagic acid and 5.0 mg/kg for total ellagic acid.The recoveries at low，medium and high spiked levels ranged from 86.7%to 113.6%with relative standard deviations(RSD) not more than 10%.The results indicated that this approach was simple，sensitive and accurate，and was applicable for the determination of content of ellagic acid in strawberry.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);free ellagic acid;total ellagic acid;strawberry

2016-06-15；

2016-07-25

科技創新能力建設專項(KJCX20140302，KJCX20150602)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.013

O656.63;S816.7

A

1004-4957(2016)12-1591-05

*通訊作者：張開春，博士，研究員，研究方向：果樹資源育種及果品質量安全，Tel:010-82596007，E-mail:zkc8848@126.com