基于藍(lán)光技術(shù)的數(shù)字化分子診斷與檢測(cè)技術(shù)

徐鵬濤,師茂林,張玲玲,張校亮,李曉春

(太原理工大學(xué) 物理與光電工程學(xué)院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030024)

?

基于藍(lán)光技術(shù)的數(shù)字化分子診斷與檢測(cè)技術(shù)

徐鵬濤,師茂林,張玲玲,張校亮,李曉春*

(太原理工大學(xué) 物理與光電工程學(xué)院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030024)

該文基于課題組前期對(duì)CD/DVD技術(shù)的生物光盤(pán)檢測(cè)技術(shù)的研究基礎(chǔ)上，建立了基于全新的BD技術(shù)的分子定量檢測(cè)技術(shù)。與CD和DVD相比，BD光驅(qū)具有更小的激光聚焦光斑，實(shí)現(xiàn)了更高的檢測(cè)通量與檢測(cè)靈敏度。通過(guò)在藍(lán)光光盤(pán)表面制備大小和灰度不同的墨點(diǎn)陣列，并利用標(biāo)準(zhǔn)BD光驅(qū)結(jié)合光盤(pán)質(zhì)量診斷軟件進(jìn)行測(cè)試，分析了系統(tǒng)的橫向分辨率以及用于定量檢測(cè)的可行性，結(jié)果表明藍(lán)光檢測(cè)系統(tǒng)具有較高的靈敏度和橫向分辨率(<100 μm)。在BD光盤(pán)表面成功制備了生物素—鏈霉親和素結(jié)合反應(yīng)陣列，利用標(biāo)準(zhǔn)BD光驅(qū)以及糾錯(cuò)軟件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鏈霉親和素的定量檢測(cè)。

藍(lán)光光驅(qū)/光盤(pán)；質(zhì)量診斷；靈敏度；即時(shí)檢測(cè)

傳統(tǒng)的生物分子診斷方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本昂貴、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，因此，許多研究集中于開(kāi)發(fā)面向普通用戶的低成本即時(shí)檢測(cè)(POC，Point of care)設(shè)備，如早早孕試紙條、比色卡、血糖儀等定性或定量的檢測(cè)裝置[1-2]。

利用常見(jiàn)的消費(fèi)類(lèi)電子設(shè)備如手機(jī)、掃描儀、數(shù)碼相機(jī)等，使普通用戶快速有效地實(shí)現(xiàn)分子診斷或有害物質(zhì)檢測(cè)，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[3-4]。計(jì)算機(jī)光驅(qū)/光碟播放機(jī)作為一款普及性較高的數(shù)字化讀取設(shè)備，具有精密的光學(xué)讀取機(jī)制和伺服控制系統(tǒng)，而普通光盤(pán)又可替代傳統(tǒng)的硅片、玻璃片等作為生物分子反應(yīng)的基底，在此基礎(chǔ)上，國(guó)內(nèi)外已有許多對(duì)利用光驅(qū)讀取生物光盤(pán)的探索研究，并研發(fā)了不同的檢測(cè)體系，從技術(shù)實(shí)現(xiàn)的角度，主要分為兩類(lèi)：通過(guò)對(duì)光驅(qū)硬件的改造以及本課題組提出的基于標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)/光盤(pán)的數(shù)字化分子檢測(cè)技術(shù)。Lange 等[5]利用改裝過(guò)的CD光驅(qū)激光探頭實(shí)現(xiàn)了免疫檢測(cè)反應(yīng)的定量分析；Potyrailo等[6]直接從CD光驅(qū)的光電探測(cè)器提取模擬信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)金屬離子的定量檢測(cè)，Ramachandraiah等[7]在標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)上增加光電探測(cè)器，將光驅(qū)改裝成激光掃描顯微鏡，對(duì)CD4+細(xì)胞進(jìn)行成像，這類(lèi)技術(shù)由于對(duì)光驅(qū)進(jìn)行了改造，因此普通用戶無(wú)法利用標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)進(jìn)行檢測(cè)。于化忠課題組在2008年提出了基于標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)/光盤(pán)技術(shù)的數(shù)字化分子檢測(cè)技術(shù)[8-10]，該方法借助于CD光盤(pán)數(shù)據(jù)保護(hù)機(jī)制，利用CD標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)結(jié)合光盤(pán)質(zhì)量診斷軟件實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上，本課題組將這一基于標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)/光盤(pán)的數(shù)字化分子檢測(cè)技術(shù)從CD系統(tǒng)發(fā)展到DVD系統(tǒng)[11]，并實(shí)現(xiàn)了孕酮hCG[12]、毒品嗎啡和可卡因[13]以及重金屬離子[14]的高靈敏度定量檢測(cè)。

隨著存儲(chǔ)需求的增加，光盤(pán)技術(shù)已由DVD迅速發(fā)展到BD(Blu-ray disc)。與DVD技術(shù)相比，BD采用更短的激光波長(zhǎng)和更高的數(shù)值孔徑，使聚焦光斑尺寸大大縮小，記錄密度增加[15]。對(duì)基于光驅(qū)的檢測(cè)技術(shù)而言，更小的光斑意味著更高的檢測(cè)通量和靈敏度，基于此，本文研究了基于BD技術(shù)的數(shù)字化分子檢測(cè)方案，利用BD表面內(nèi)酯的水解反應(yīng)，成功地將惰性BD轉(zhuǎn)化為有活性的生物基底，并用標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)光光驅(qū)結(jié)合光盤(pán)質(zhì)量診斷軟件，實(shí)現(xiàn)了BD表面生物素—鏈霉親和素反應(yīng)的定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外臭氧清洗機(jī)(PSD-UV，美國(guó)Novascan Technologies公司)，超純水系統(tǒng)(Genpure UV，美國(guó)Thermo公司)，電子天平(美國(guó)Ohaus公司)，微量移液槍(瑞士梅特勒公司)，藍(lán)光一次性寫(xiě)入盤(pán)(25GB BD-R，日本威寶公司)，藍(lán)光刻錄機(jī)(PX-LB950UE，日本浦科特公司)。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、2-嗎啉乙磺酸(MES)、吐溫20、明膠(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；氯化鈉、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、牛血清蛋白(BSA)、氫氧化鈉(美國(guó)Aladdin公司)；疊氮化鈉(NaN3，北京索萊寶科技有限公司)；氨基修飾的生物素(EZ-link@Amine-PEG2-biotin，美國(guó)Thermo Scientific公司)；納米金-鏈霉親和素結(jié)合物(Nanogold-streptavidin conjugate)、銀染試劑盒(美國(guó)Nanoprobes公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.20 MΩ·cm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 墨點(diǎn)陣列的制備與讀取 使用藍(lán)光刻錄機(jī)和Blu-ray Disc Suite刻錄軟件(訊連科技有限公司)將高清格式的電影(22GB)刻錄到光盤(pán)上。利用帶有前置托盤(pán)的噴墨打印機(jī)(R270，日本愛(ài)普生有限公司)將墨點(diǎn)陣列打印在光盤(pán)表面，配套的Print CD用來(lái)設(shè)計(jì)打印樣式和控制打印過(guò)程，本文設(shè)計(jì)了兩種類(lèi)型的墨點(diǎn)陣列：第一種為大小不一、灰度一致的墨點(diǎn)陣列；第二種為大小一致、灰度不同的墨點(diǎn)陣列。利用標(biāo)準(zhǔn)光驅(qū)結(jié)合光盤(pán)質(zhì)量診斷軟件PlexUtilities(v 1.3.3，http://plextoramericas.com)對(duì)光盤(pán)進(jìn)行讀取，速度為4X。

1.2.2 生物素—鏈霉親和素反應(yīng)陣列的制備與讀取 首先將BD表面浸泡在0.1 mol/L的NaOH溶液中，溫度為(55±1) ℃，水解90 min，用水徹底沖洗光盤(pán)表面并用氮?dú)獯蹈桑缓髮⒐獗P(pán)浸泡在活化液(100 mmol/L EDC，25 mmol/L NHS，溶劑為pH 5.8的MES緩沖液)中，活化4 h。在光盤(pán)表面覆蓋聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流體通道板，將生物素溶液注入微通道中，固定8 h后，將緩沖液(pH 7.4，所含成分為150 mmol/L NaCl，0.8% BSA，0.1% gelatin，0.05% Tween 20，0.05% NaN3)注入通道，封閉2 h，隨后將不同濃度的納米金-鏈霉親和素結(jié)合物依次注入不同的通道中，靜置1 h，用銀染液(48 mmol/L乙酸銀和182 mmol/L對(duì)苯二酚)對(duì)反應(yīng)區(qū)域銀染5 min，徹底沖洗光盤(pán)并用氮?dú)獯蹈珊螅瑢?duì)光盤(pán)進(jìn)行讀取，讀取過(guò)程與“1.2.1”方法相同。

圖1 藍(lán)光系統(tǒng)糾錯(cuò)塊示意圖Fig.1 Schematic representation of the error correction code(ECC) block in a Blu-ray system

2 結(jié)果與討論

2.1 BD質(zhì)量診斷原理

BD系統(tǒng)以糾錯(cuò)塊的形式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行保護(hù)。圖1是一個(gè)糾錯(cuò)塊的示意圖，白色部分代表用戶數(shù)據(jù)，容量為64 kB；藍(lán)色部分代表用戶數(shù)據(jù)的校驗(yàn)碼；其余4列稱(chēng)為警哨列。用戶數(shù)據(jù)受到長(zhǎng)距碼(Long Distance Code，LDC)的保護(hù)，長(zhǎng)距碼由304個(gè)LDC碼字組成，這些碼字按照2×2的方式進(jìn)行排列，形成一個(gè)496行×152列的矩陣塊；糾錯(cuò)塊最左側(cè)的一列由同步位形式構(gòu)成，其余3列由地址信息、控制信息及其校驗(yàn)碼組成，地址信息、控制信息受到突發(fā)指示子碼(Burst Indicating Subcode，BIS)的保護(hù)，突發(fā)指示子碼由24個(gè)BIS碼字構(gòu)成，BIS碼字經(jīng)過(guò)交錯(cuò)交叉，形成一個(gè)496行×3列的矩陣塊，由于BIS列和同步位列均可以指示長(zhǎng)度不小于40字節(jié)的突發(fā)錯(cuò)誤的位置，因此統(tǒng)稱(chēng)為警哨列。對(duì)于藍(lán)光系統(tǒng)而言，糾錯(cuò)塊是基本的數(shù)據(jù)質(zhì)量測(cè)試單元，光盤(pán)質(zhì)量診斷軟件有兩個(gè)測(cè)試參數(shù)：LDC和BIS，其中LDC代表每個(gè)糾錯(cuò)塊中LDC碼字發(fā)生校驗(yàn)錯(cuò)誤的個(gè)數(shù)，BIS代表每個(gè)糾錯(cuò)塊中BIS碼字發(fā)生校驗(yàn)錯(cuò)誤的個(gè)數(shù)。

2.2 墨點(diǎn)陣列的分析

為了研究藍(lán)光檢測(cè)系統(tǒng)的橫向分辨率，首先對(duì)第一種墨點(diǎn)陣列進(jìn)行測(cè)試。如圖2所示，在光盤(pán)表面打印4組直徑分別為0.1，0.2，0.3，0.4 mm的墨點(diǎn)；在LDC和BIS模式下均出現(xiàn)8個(gè)明顯的檢測(cè)信號(hào)，且隨著墨點(diǎn)直徑的增加，檢測(cè)信號(hào)的幅值和寬度均增加，并且LDC模式下的信號(hào)強(qiáng)度是BIS模式下的50倍之多，這是由于LDC碼字中用戶數(shù)據(jù)占碼字總?cè)萘康?7%，對(duì)于表面物質(zhì)會(huì)更加敏感，因此本文選用LDC作為檢測(cè)參數(shù)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，藍(lán)光檢測(cè)系統(tǒng)的橫向分辨率在100 μm以下，遠(yuǎn)優(yōu)于DVD系統(tǒng)[11-12]。

圖3 光盤(pán)表面墨點(diǎn)的邏輯位置與物理位置的關(guān)系圖Fig.3 Relationship between radial distance and logical position of the ink-spots on a BD

由于檢測(cè)結(jié)果橫坐標(biāo)是光盤(pán)的邏輯位置，而在多樣品的測(cè)試中，樣品的物理位置更易于觀察，基于存儲(chǔ)容量正比于存儲(chǔ)面積這一原理(存儲(chǔ)密度不變)，可獲得光盤(pán)物理位置與邏輯位置轉(zhuǎn)換關(guān)系式：

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了驗(yàn)證藍(lán)光系統(tǒng)作為生物化學(xué)分子定量檢測(cè)系統(tǒng)的可行性，進(jìn)一步對(duì)第二種類(lèi)型即尺寸一致但灰度不同的墨點(diǎn)陣列進(jìn)行檢測(cè)與分析，如圖4A所示，隨著墨點(diǎn)顏色的加深，信號(hào)幅值增加，而寬度(1.4±0.1) mm保持不變。隨后比較了墨點(diǎn)引起的光學(xué)灰度比(ODR，Optical darkness ratio)與LDC 密度(單位面積內(nèi)的LDC個(gè)數(shù))的關(guān)系。傳統(tǒng)的ODR檢測(cè)方法的表達(dá)式為[16]：ODR=(Ib-Is)/Ib，式中，Ib代表背景的灰度，Is代表反應(yīng)陣列的灰度。如圖4B所示，當(dāng)ODR從0.14增至0.23時(shí)，錯(cuò)誤數(shù)密度增加較快，當(dāng)ODR從0.23增至0.52時(shí)，錯(cuò)誤數(shù)密度增加較慢，與DVD系統(tǒng)觀察到的線性關(guān)系不同[11-13]。這是由于藍(lán)光檢測(cè)系統(tǒng)的糾錯(cuò)模式更加靈敏[15]，所以當(dāng)墨點(diǎn)顏色在較淺范圍內(nèi)變化時(shí)，激光光強(qiáng)的變化導(dǎo)致 LDC變化較快，而當(dāng)墨點(diǎn)顏色在較深范圍內(nèi)變化時(shí)，大部分激光被吸收，使得LDC變化較慢。

2.3 BD系統(tǒng)對(duì)生物素——鏈霉親和素反應(yīng)的定量檢測(cè)及其與DVD系統(tǒng)的比較

鏈霉親和素又稱(chēng)抗生物素蛋白，因其和生物素之間有著很強(qiáng)的非共價(jià)作用(Ka≈1015mol-1·L)，所以生物素——親和素反應(yīng)系統(tǒng)在生物分子檢測(cè)中常被作為模型診斷工具[8-9,11]。圖5頂部插圖為經(jīng)過(guò)銀染后的生物光盤(pán)的光學(xué)圖片，從光盤(pán)外圈到內(nèi)圈，圖中標(biāo)號(hào)1～7的條帶濃度分別為0.0，0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 μg/mL。從圖5可以看出，隨著鏈霉親和素濃度的增加，銀染條帶亮度逐漸增強(qiáng)。圖5A為生物光盤(pán)在LDC模式下的檢測(cè)結(jié)果，隨著鏈霉親和素濃度的升高，檢測(cè)信號(hào)的幅值迅速增強(qiáng)，當(dāng)濃度增至0.8 μg/mL時(shí)，檢測(cè)信號(hào)達(dá)到飽和。圖5B中實(shí)線為L(zhǎng)DC 密度隨鏈霉親和素濃度變化的關(guān)系，可以看出隨著濃度的上升，LDC密度迅速增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.8 μg/mL后，LDC密度趨于飽和。

進(jìn)一步考察了PIF(DVD系統(tǒng)中的糾錯(cuò)參數(shù))密度與分析物濃度的關(guān)系，結(jié)果如圖5B所示，隨著分析物濃度的增加，PIF 密度的增長(zhǎng)速度比LDC密度緩慢，直至分析物濃度達(dá)1.0 μg/mL時(shí)，PIF 密度才趨于飽和。由結(jié)果可知，BD系統(tǒng)可檢測(cè)到的鏈霉親和素的最低濃度小于0.1 μg/mL，比DVD系統(tǒng)的檢出限(0.2～0.4 μg/mL)更低，且檢測(cè)靈敏度高于DVD系統(tǒng)，但隨著分析物濃度的增加，BD系統(tǒng)的檢測(cè)信號(hào)更易達(dá)到飽和。

相較于DVD系統(tǒng)，BD系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)低檢出限和高靈敏度的主要原因有：①由于BD系統(tǒng)采用比DVD系統(tǒng)更短波長(zhǎng)的藍(lán)色激光(405 nm)和更高數(shù)值孔徑的物鏡，使得光驅(qū)在讀取BD光盤(pán)時(shí)其表面光斑面積只有讀取DVD光盤(pán)時(shí)表面光斑面積的1/14，所以低濃度的銀染條帶會(huì)對(duì)BD系統(tǒng)的檢測(cè)光斑產(chǎn)生更大的消光作用(例如散射和吸收等)，使BD更易產(chǎn)生校驗(yàn)錯(cuò)誤；②由于BD的存儲(chǔ)密度(25 GB)是DVD(4.7 GB)的5倍之多，所以同樣大小的銀染條帶覆蓋的BD字節(jié)數(shù)更多；③藍(lán)光檢測(cè)系統(tǒng)的糾錯(cuò)模式更加靈敏。

3 結(jié) 論

本文提出了基于藍(lán)光技術(shù)的數(shù)字化分子檢測(cè)方案，通過(guò)對(duì)光盤(pán)表面微尺度墨點(diǎn)陣列的分析，表明了藍(lán)光檢測(cè)系統(tǒng)的橫向分辨率小于藍(lán)光光盤(pán)表面的光斑直徑(138 μm)，可以檢測(cè)出直徑小于100 μm的墨點(diǎn)；通過(guò)對(duì)生物素——鏈霉親和素結(jié)合反應(yīng)的分析，得出相較于DVD系統(tǒng)，BD系統(tǒng)能夠取得較低的檢出限和較高的靈敏度，這是由于其采用了更短波長(zhǎng)的藍(lán)色激光和更高數(shù)值孔徑的目鏡以及BD存儲(chǔ)密度的大幅提升和更加靈敏的藍(lán)光檢測(cè)系統(tǒng)糾錯(cuò)模式，使其可以成為應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)分析的低成本即時(shí)檢測(cè)工具。

[1] Gubala V，Harris L F，Ricco A J，Tan M X，Williams D E.Anal.Chem.,2012，84(2):487-515.

[2] Xu J，Zhang N，Tian H Z，Wang D，Li Y，Liu H Y，Cao J J.J.Instrum.Anal.(徐靜，張寧，田宏哲，王丹，李妍，劉慧穎，曹際娟.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2016，35(3):299-304.

[3] Yang D D，Zhang X L，Cui C E,Tan K，Li X C.J.Instrum.Anal.(楊冬冬，張校亮，崔彩娥，譚慷，李曉春.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2015，34(10):1179-1184.

[4] Meng X J，Schultz C W，Cui C E，Li X C，Yu H Z.Sens.ActuatorsB，2015，215:577-583.

[5] Lange S A，Roth G，Wittemann S，Lacoste T，Vetter A，Gr?ssle J，Kopta S，Kolleck M，Breitinger B，Wick M,H?rber J K H，Dübel S，Bernard A.Angew.Chem.Int.Ed.,2006，45(2):276-279.

[6] Potyrailo R A,Morris W G，Leach A M，Sivavec T M，Wisnudel M B，Boyette S.Anal.Chem.，2006，78(16):5893-5899.

[7] Ramachandraiah H，Amasia M,Cole J，Sheard P，Pickhaver S，Walker C,Wirta V,Lexow P，Lione R，Russom A.LabChip,2013，13(8):1578-1585.

[8] Li Y C，Ou L M L，Yu H Z.Anal.Chem.，2008，80(21):8216-8223.

[9] Yu H Z，Li Y C，Ou L M L.Acc.Chem.Res.,2013，46(2):258-268.

[10] Li X C，Li Y C，Yu H Z.Chin.Sci.Bull.(李曉春，李運(yùn)超，于化忠.科學(xué)通報(bào))，2013，58(9):777-782.

[11] Zhao X J，Li X C,Cui C E,Yu H Z.Sens.ActuatorsB，2014，195:116-122.

[12] Li X C，Weng S，Ge B X，Yao Z H，Yu H Z.LabChip,2014，14(10):1686-1694.

[13] Zhang L L，Li X C，Li Y C，Shi X L，Yu H Z.Anal.Chem.,2015，87(3):1896-1902.

[14] Zhang L L，Wong J X H，Li X C，Li Y C，Yu H Z.Anal.Chem.,2015，87(10):5062-5067.

[15] Blu-ray Disc Association.White Paper Blu-ray DiscTMFormat:General.[2016-05-31].http://bluraydisc.purestone.co.uk/Assets/Downloadablefile/White_Paper_General_4 th_20150817_clean.pdf.

[16] Gupta S，Huda S,Kilpatrick P K,Velev O D.Anal.Chem.,2007，79(10):3810-3820.

Digitized Molecular Detection Based on Blu-ray Technology

XU Peng-tao，SHI Mao-lin，ZHANG Ling-ling，ZHANG Xiao-liang，LI Xiao-chun*

(Key Laboratory of Advanced Transducers and Intelligent Control System(Ministry of Education and Shanxi Province)，College of Physics and Optoelectronics，Taiyuan University of Tecnnology，Taiyuan 030024，China)

The rapid quantitative detection of biochemical molecule has the advantages of simple handling，rapid detection and easy on-site analysis，thus it has a widespread application prospect in many fields such as medical diagnosis，food safety and environment monitoring.Molecular detection technology based on optical disc and optical drive can be used as the next generation molecular diagnostic tool.In this paper，a bran-new quantitative detection of molecule based on bio-disc(BD) was proposed and studied around our previous research on BD detection based on CD/DVD technology.Compared with CD and DVD，Blu-ray drive has a smaller focus laser size，which means higher detection throughput and sensitivity.The quantitation capability and the lateral resolution of this system were evaluated by preparing ink-spot arrays with different sizes and darkness on the surface of BDs which were subsequently examined with a standard Blu-ray drive in conjunction with disc quality check software，and the Blu-ray detection system exhibits the higher sensitivity and lateral resolution(<100 μm).In the end，biotin-streptavidin binding assay was successfully prepared on the surface of BDs，and the quantitative detection of streptavidin was achieved by a standard Blu-ray drive in conjunction with disc quality check software.

Blu-ray drive/disc；quality check；sensitivity；point of care

2016-03-10；

2016-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(61174010，21505098，21575098)；山西省國(guó)際合作項(xiàng)目(2015081019);山西省平臺(tái)基地和人才專(zhuān)項(xiàng) 優(yōu)秀人才科技創(chuàng)新項(xiàng)目(201605D211033)；山西省高等學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2015123)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.015

O656.3;Q563.7

A

1004-4957(2016)12-1601-05

*通訊作者：李曉春，博士，教授，研究方向：光電分子檢測(cè)技術(shù)，Tel:0351-3176638，E-mail:lixiaochun@tyut.edu.cn