雌激素受體對乳腺癌細(xì)胞截短型神經(jīng)激肽受體-1的調(diào)控作用

劉曉彬，仝穎娜，張露芳，周云麗

雌激素受體對乳腺癌細(xì)胞截短型神經(jīng)激肽受體-1的調(diào)控作用

劉曉彬，仝穎娜，張露芳，周云麗△

目的 探討雌激素受體α（ERα）陽性的乳腺癌細(xì)胞中ERα對神經(jīng)激肽受體-1截短型變異體（NK1R-Tr）的調(diào)控作用，以及ERα是否通過調(diào)控NK1R-Tr的表達(dá)，間接調(diào)控細(xì)胞的增殖能力。方法染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ERα是否可以結(jié)合到NK1R-Tr啟動(dòng)子上游的ERα反應(yīng)元件，直接調(diào)控NK1R-Tr的表達(dá)；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證ERα是否對NK1R-Tr的表達(dá)起正性調(diào)控作用。Western blot實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D的ERα和NK1R-Tr在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)情況；以及在ERα激動(dòng)劑雌二醇（E2）刺激的條件下，小干擾RNA敲除ERα后，NK1R-Tr在不同水平的表達(dá)情況；小干擾RNA敲除NK1R-Tr后，CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測敲除NK1R-Tr的乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果在NK1R-Tr基因啟動(dòng)子上游存在ERα的反應(yīng)元件，ERα在E2存在條件下作用于該反應(yīng)元件，對NK1R-Tr的表達(dá)起正性調(diào)控作用。同樣在E2刺激的條件下，敲除乳腺癌細(xì)胞MCF-7內(nèi)源性ERα后，NK1R-Tr在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)均下降；且敲除NK1R-Tr的MCF-7細(xì)胞增殖能力較未敲除組明顯降低。結(jié)論在ERα陽性的乳腺癌細(xì)胞中，ERα正性調(diào)控NK1R-Tr的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。

乳腺腫瘤；細(xì)胞系，腫瘤；雌激素受體α；受體，神經(jīng)激肽1；RNA，小分子干擾；染色質(zhì)免疫沉淀法；細(xì)胞增殖；熒光素酶報(bào)告基因

乳腺癌（breast cancer,BC）作為全球女性最常見的惡性腫瘤，正日益受到全社會(huì)的關(guān)注，其致死率在各種女性腫瘤中位列第二［1］。Ho等［2］研究顯示大約70%的乳腺癌患者存在雌激素受體α（ERα）過表達(dá)，且對內(nèi)分泌治療敏感［3］。在分子水平上，ERα作為轉(zhuǎn)錄因子，在其配體17β-雌二醇（E2）存在的條件下，可以調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與到包括乳腺癌在內(nèi)的多種生理和病理活動(dòng)中［4］。前期研究表明，神經(jīng)激肽受體-1（NK1R）主要有2個(gè)亞型：全長型亞型NK1R-FL和截短型亞型NK1R-Tr，并且NK1R-Tr的表達(dá)量隨腫瘤惡性程度的增高而增高［5-7］，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［8］。盡管有大量關(guān)于ERα所參與的病理生理過程的報(bào)道［9］，但ERα與NK1RTr之間的調(diào)控機(jī)制卻鮮有研究。在乳腺癌細(xì)胞中，ERα是否能通過基因和非基因組途徑與NK1R-Tr相互作用，從而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖能力尚不明確，本研究將對這一問題進(jìn)行分析，旨在為乳腺癌的治療與判斷預(yù)后提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與主要試劑乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7和T47D與人腎臟HEK-293工具細(xì)胞均購自美國典型菌種保藏中心（ATCC）。β-actin、ERα與NK1R-Tr PCR引物，NK1R-Tr和ERα的小干擾RNA（siRNA-NK1R-Tr，siRNA-ERα）均購自廣州銳博生物科技有限公司。鼠源βactin單克隆抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；兔源ERα單克隆抗體購自美國CST公司；羊抗鼠和羊抗兔HRP標(biāo)記的IgG購自英國的Upstate公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購自美國Thermo公司。染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）試劑盒購自美國CST公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)試劑公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（lipo2000）購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 ERα陽性的乳腺癌細(xì)胞系的選擇和蛋白免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白方法提取乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7和T47D細(xì)胞總蛋白，MDAMB-231細(xì)胞蛋白作為ERα的陰性對照蛋白，MCF-7和T47D細(xì)胞蛋白為ERα陽性待檢測蛋白。以同樣的方法提取野生型和干擾型（敲除NK1R-Tr和ERα）乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D總蛋白，在4%SDS-PAGE濃縮凝膠和10% SDS-PAGE分離凝膠電泳分離；電泳結(jié)束后切去濃縮膠部分，250 mA、90 min電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，牛奶常溫封閉1 h；TBST輕輕沖洗，裁剪ERα、NK1R-Tr和β-actin目的條帶分別置于ERα特異性一抗（1∶2 000），NK1R的N末端特異性一抗（1∶100）和β-actin特異性一抗（1∶5 000）中孵育，4℃過夜。二抗1∶8 000稀釋，將PVDF膜置于二抗孵育液中室溫振搖孵育1 h，用ECL發(fā)光劑顯示陽性條帶。

1.2.2 CHIP培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞，在培養(yǎng)上清液中加入ERα激動(dòng)劑E2，待細(xì)胞生長覆蓋率為80%～90%時(shí)，收集細(xì)胞，冰PBS洗3次，用1%甲醛交聯(lián)10 min，加甘氨酸中和甲醛，棄廢液，冰PBS重復(fù)洗3次。加入Micrococcal Nuclease 37℃孵育20 min，加0.5 mol/L EDTA終止消化。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（ScientzⅡD）20%輸出功率，超聲破碎細(xì)胞后離心，取上清并分為實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組。實(shí)驗(yàn)組加入Anti-ERα抗體，陰性對照組加入非特異性IgG，均4℃孵育過夜，待抗體與ERα-DNA復(fù)合物相互結(jié)合后，加入Protein G磁珠，沉淀抗體-ERα-DNA復(fù)合物，并對沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗。洗脫，得到可能富集ERα-DNA的復(fù)合物，解交聯(lián)，用DNA純化柱純化并富集被沉淀下來的DNA片段，對包括NK1R 5′側(cè)旁區(qū)ERα的反應(yīng)元件在內(nèi)的NK1R-Tr的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量（RT）-PCR分析。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增可能含有ERα的反應(yīng)元件在內(nèi)的NK1R-Tr的DNA啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中，形成pMIR-luciferase-NK1R-Tr-WT質(zhì)粒；并用突變試劑盒構(gòu)建pMIR-luciferase-NK1R-Tr-MUT質(zhì)粒。將表達(dá)ERα的質(zhì)粒ERα-plasmid與pMIR-luciferase-NK1R-Tr-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK-293細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，將不表達(dá)ERα的陰性對照質(zhì)粒ERα-HK與pMIR-luciferase-NK1R-Tr-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK-293細(xì)胞作為陰性對照組，加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，檢測熒光強(qiáng)度，將實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果與對照組進(jìn)行比較。

1.2.4 小干擾RNA的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D，對數(shù)生長期時(shí)將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，饑餓過夜。將10 μL lipo2000和10 μL溶好的siRNA分別加入400 μL無血清培養(yǎng)液中，各自孵育10 min后混合孵育20 min，緩慢滴加于培養(yǎng)皿中，邊滴加邊混勻。于轉(zhuǎn)染后6 h換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，并觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。敲除ERα的siRNA和敲除NK1R-Tr的siRNA分別有3個(gè)序列，只選取2個(gè)最有效的序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，敲除ERα的siRNA標(biāo)記為siRNA-#1、siRNA-#2，敲除NK1R-Tr的siRNA標(biāo)記為siRNA-*1、siRNA-*2。

1.2.5 RT-PCRTrizol處理對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，提取野生型和干擾型（敲除ERα）MCF-7細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用特異性引物進(jìn)行RT-PCR。NK1R-Tr引物上游5′-GACCATCTACATACACAGTGGC-3′，下游5′-GGCT?GAGTTGTGTGATGATAAG-3′，ERα引物上游5′-TCCAG?CACCCTGAAGTCTCT-3′，下游5′-AGATGCTCCATGCCTTT?GTT-3′，內(nèi)參照β-actin引物上游為5′-TTGCCGACAGGAT?GCAGAAGGA-3′，下游為5′-AGGTGGACAGCGAGGCCAG?GAT-3′。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。NK1R-Tr的相對表達(dá)量（RQ）=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照=（Ct樣品NK1R-Tr-Ct樣品β-actin）-（Ct對照NK1R-Tr-Ct對照βactin）。

1.2.6 CCK-8比色法檢測細(xì)胞的增殖能力培養(yǎng)siRNA-*1敲除NK1R-Tr的MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞，對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行消化計(jì)數(shù)，接種于96孔板，接種密度為2 000個(gè)/孔。于貼壁后每孔加8%的CCK-8溶液，37℃孵育3 h后測0 day的光密度（OD）值，以同樣的方法檢測1、2、3、4、5 d的OD值。每天每個(gè)細(xì)胞做8個(gè)復(fù)孔，取其OD值的平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)siRNA-*1敲除NK1R-Tr的MCF-7細(xì)胞和T47D細(xì)胞，對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行消化計(jì)數(shù)后接種于6 cm培養(yǎng)皿中，搖勻。接種密度為500個(gè)/培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)7～14 d。甲醇固定10 min，0.005%的結(jié)晶紫染色20 min。以大于50個(gè)細(xì)胞作為1個(gè)克隆，顯微鏡下計(jì)數(shù)。每種處理的細(xì)胞做3個(gè)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件處理，計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)以及方差齊性檢驗(yàn)，以表示，兩個(gè)樣本均數(shù)的組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot結(jié)果驗(yàn)證乳腺癌細(xì)胞系ERα的表達(dá)情況在內(nèi)參β-actin表達(dá)量一致的條件下，MDA-MB-231細(xì)胞的ERα表達(dá)為陰性，MCF-7和T47D細(xì)胞的ERα的表達(dá)為陽性，且MCF-7的表達(dá)量較T47D細(xì)胞高，見圖1。

Fig.1 ERα expression in breast cancer cells detected by Western blot assay圖1 ERα在乳腺癌細(xì)胞系表達(dá)的Western blot檢測

2.2 CHIP與熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明ERα對NK1R-Tr的正調(diào)控作用在ERα陽性的乳腺癌細(xì)胞MCF-7中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CHIP結(jié)果顯示在E2刺激的條件下，Anti-ERα組的NK1R-Tr表達(dá)量較IgG陰性對照組明顯升高（t=6.495，P＜0.01），見圖2。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染了NK1R-Tr-WT報(bào)告基因質(zhì)粒與表達(dá)ERα質(zhì)粒ERα-piasmid的HEK-293細(xì)胞中，熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染NK1R-Tr-WT報(bào)告基因和ERα-HK的對照組明顯升高（t=3.289，P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染了NK1R-Tr-MUT和ERα-plasmid組，轉(zhuǎn)染了NK1R-Tr-MUT和ERα-HK組的熒光素酶活性均較轉(zhuǎn)染NK1R-Tr-MUT和ERα-HK的對照組沒有明顯差異，見圖3。

2.3 敲除MCF-7細(xì)胞內(nèi)源性ERα，NK1R-Tr表達(dá)明顯下降siRNA轉(zhuǎn)染敲除乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D的內(nèi)源性ERα后，在E2刺激的條件下Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-#1和siRNA-#2的細(xì)胞中，ERα的蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染對照序列的細(xì)胞明顯下降，并且NK1R-Tr的蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染對照序列的細(xì)胞也有明顯的下降趨勢，見圖4。RTPCR檢測敲除ERα的MCF-7細(xì)胞中內(nèi)源性ERα和NK1R-Tr的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，同樣在E2刺激的條件下，轉(zhuǎn)染siRNA-ERα組細(xì)胞中的ERα和NK1R-Tr的表達(dá)在mRNA水平較轉(zhuǎn)染對照序列的細(xì)胞均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tERα= 5.549，tNK1R-Tr=4.933，均P＜0.01），見圖5。

Fig.2 CHIP assay in MCF-7 cells圖2 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中染色質(zhì)免疫共沉淀產(chǎn)物的RT-PCR檢測（＊＊P＜0.01）

Fig.3 Luciferase reporter gene assay of ERα and NK1R-Tr圖3 ERα與NK1R-Tr熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（＊P＜0.05）

Fig.4 The expression of NK1R-Tr detected by Western blot assay圖4 敲除ERα的乳腺癌細(xì)胞NK1R-Tr表達(dá)的Western blot檢測

2.4 敲除乳腺癌細(xì)胞NK1R-Tr的表達(dá)，其增殖能力下降siRNA轉(zhuǎn)染敲除乳腺癌細(xì)胞MCF-7和T47D的內(nèi)源性NK1R-Tr，Western blot結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了siRNA-*1和siRNA-*2的細(xì)胞中，NK1R-Tr的蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染對照序列的細(xì)胞明顯下降，見圖6。在E2刺激的條件下，CCK-8結(jié)果顯示，從檢測的第4天開始，敲除NK1R-Tr組的MCF-7和T47D乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（4 d時(shí)，tMCF-7=3.700，tT47D=3.535，均P＜0.05；5 d時(shí)，tMCF-7=4.563，tT47D=4.316，均P＜0.05），見圖7。同樣在E2刺激的條件下，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，敲除NK1R-Tr組的MCF-7和T47D乳腺癌細(xì)胞的克隆形成能力較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tMCF-7=4.028，tT47D=4.234，均P＜0.05），見圖8。

Fig.5 ERα and NK1R-Tr expressions in MCF-7 cells detected by RT-PCR圖5 ERα與NK1R-Tr在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中表達(dá)的RT-PCR檢測（＊＊P＜0.01）

Fig.6 NK1R-Tr expression in breast cancer cells detected by Western blot assay圖6 敲除NK1R-Tr的乳腺癌細(xì)胞Western blot檢測

Fig.7 Results of CCK-8 assay of breast cancer cells after knocking out NK1R-Tr圖7 敲除NK1R-Tr的乳腺癌細(xì)胞的CCK-8實(shí)驗(yàn)（＊P＜0.05）

Fig.8 Colony formation assay of breast cancer cells after knocking out NK1R-Tr圖8 敲除NK1R-Tr的乳腺癌細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)（＊P＜0.05）

3 討論

根據(jù)ERα的表達(dá)情況可以將乳腺癌分為ERα陰性和ERα陽性兩大類，激活狀態(tài)的ERα?xí)酝炊垠w的形式進(jìn)入細(xì)胞核，與其靶基因啟動(dòng)子上游的反應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖［3,10］。ERα在乳腺癌早期的進(jìn)展過程中扮演著重要的角色，了解ERα調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制有助于建立針對ERα陽性乳腺癌的治療方案。有報(bào)道稱ERα通過調(diào)控E2依賴的轉(zhuǎn)錄作用提高了乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，但由于對雌激素受體拮抗劑治療敏感，所以ERα陽性乳腺癌患者的生存率更高［11］。

速激肽家族的重要成員P物質(zhì)（SP）通過激活并結(jié)合其偏嗜性受體NK1R發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，并且這種受體-配體復(fù)合物已被證實(shí)是抗腫瘤的獨(dú)立靶點(diǎn)［12-14］。NK1R主要分布在中樞神經(jīng)和周圍組織，在乳腺組織也呈廣泛分布［15］。目前在mRNA和蛋白水平所發(fā)現(xiàn)的人NK1R只有2種：由5個(gè)外顯子組成的全長型受體（full-length，NK1R-FL）和C-末端缺乏96個(gè)氨基酸殘基的截短型受體（Truncated，NK1R-Tr），前期研究顯示其全長型變異體NK1RFL與乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)；截短型變異體NK1R-Tr則隨著乳腺癌的進(jìn)展表達(dá)不斷升高［16］。在ERα陽性的乳腺癌細(xì)胞中，ERα是否可以通過調(diào)控NK1R-Tr的表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖能力尚不清楚。

本研究顯示，在ERα陽性的MCF-7和T47D細(xì)胞中敲除ERα后，NK1R-Tr在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)確有下降，說明ERα對NK1R-Tr有一定的調(diào)控作用，但是這種調(diào)控作用是如何實(shí)現(xiàn)的還不得而知。CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在NK1R-Tr啟動(dòng)子上游存在ERα的反應(yīng)元件，結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果可知，ERα可以通過結(jié)合到該反應(yīng)元件上，對NK1R-Tr的表達(dá)起正性調(diào)控的作用。另外值得注意的是，敲除ERα組細(xì)胞在E2刺激的條件下，NK1R-Tr的表達(dá)略有所增高，可能是因?yàn)槌鼸Rα外，E2還可以通過其他旁路作用于NK1R-Tr，并升高其表達(dá)，但這種升高作用較經(jīng)典的E2-ERα-NK1R的作用弱。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小干擾敲除乳腺癌細(xì)胞內(nèi)源性NK1R-Tr后，MCF-7和T47D細(xì)胞的增殖能力明顯降低，這說明NK1R-Tr的高表達(dá)確實(shí)與癌細(xì)胞高增殖能力相關(guān)。總之，本項(xiàng)研究所有結(jié)果均指向E2-ERα-NK1R的正性調(diào)控機(jī)制，并且這一機(jī)制可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖能力。

綜上所述，將NK1R-Tr調(diào)控細(xì)胞增殖的能力與ERα調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制聯(lián)系在一起，就是把SPNK1R所參與的體內(nèi)神經(jīng)調(diào)節(jié)與E2-ERα為代表的體內(nèi)內(nèi)分泌調(diào)控系統(tǒng)交聯(lián)起來，這一調(diào)控機(jī)制當(dāng)中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常調(diào)節(jié)，任一指標(biāo)出現(xiàn)異常表達(dá)，均可以成為乳腺癌發(fā)生發(fā)展的潛在因素，所以明確這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的確切機(jī)制可能為臨床乳腺癌患者的治療和判斷預(yù)后提供一定的理論依據(jù)。盡管E2-ERα-NK1R與乳腺癌進(jìn)展之間的關(guān)系以及NK1R抑制劑的作用還有待進(jìn)一步深入驗(yàn)證，但ERα-NK1R-Tr調(diào)控通路已成為乳腺癌治療重要的潛在新靶點(diǎn)。

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（2016-10-18收稿 2016-11-07修回）

（本文編輯 李國琪）

Study on the regulation of ERα on NK1R-Tr in breast cancer cells

LIU Xiaobin,TONG Yingna,ZHANG Lufang,ZHOU Yunli△
Department of Clinical Laboratory,Cancer Institute and Hospital,Tianjin Medical University,National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China△

ObjectiveTo analyze the regulation of estrogen receptor α(ERα)on truncated neurokinin-1 receptor (NK1R-Tr),and the influence of this regulation on cell proliferation in estrogen receptor-positive breast cancer cell lines.MethodsThe chromatin immune coprecipitation(CHIP)was used to observe the transcriptional regulation function of ERα on NK1R-Tr in breast cancer cells.Luciferase reporter gene assay was used to verify whether ERα played a positive regulatory role in the expression of NK1R-Tr.Western blot assay and real-time-PCR were used to detect the expression of ERα and NK1R-Tr in breast cancer cells,MCF-7 and T47D,as well as the expression of NK1R-Tr protein and mRNA level.NK1R-Tr levels were also detected after using estradiol(E2,ERα agonist)and small interfering RNA(knock out ERα).CCK-8 and clone formation experimen were used to detect the proliferation ability of breast cancer cells after knocking out NK1R-Tr with small interfering RNAs.ResultsCHIP test and Luciferase reporter gene assay proved that ERα can positively regulate the expression of NK1R-Tr via the ERα sequences in the upstream of the NK1R-Tr gene promoter.The expression of NK1R-Tr at both protein level and mRNA level dropped in the estrogen receptor-positive breast cancer cell line MCF-7 upon knocking out ERα.After knocking out NK1R-Tr,the proliferation ability of estrogen receptorpositive breast cancer cells was lower than that of the control group.ConclusionThe ERα positively regulates the expression of NK1R-Tr,resulting in the increased cell proliferation in estrogen positive breast cancer cells.

breast neoplasms;cell line,tumor;estrogen receptor alpha;receptors,neurokinin-1;RNA,small interfering;chromatin immunoprecipitation;cell proliferation;luciferase reporter

R737.9

A

10.11958/20161193

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81201653）

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300060）

劉曉彬（1990），女，碩士研究生，主要從事乳腺癌神經(jīng)激肽受體表達(dá)調(diào)控的研究

△通訊作者E-mail:zhouyunli@tjmuch.com