谷氨酰胺對小細胞肺癌H446細胞增殖和生存的影響

徐鵬育，李家印，苗亞靜，高翠翠，沈堯，靳芳，仇曉菲

谷氨酰胺對小細胞肺癌H446細胞增殖和生存的影響

徐鵬育，李家印，苗亞靜，高翠翠，沈堯，靳芳，仇曉菲△

目的 觀察谷氨酰胺（Gln）對小細胞肺癌H446細胞增殖和生存的影響，并探究其機制。方法應用CCK-8試劑盒檢測Gln（+）組和Gln（-）組H446細胞在0、24、48、72、96 h的增殖情況，篩選出最佳時間，采用Annexin V-FITC/PI雙染法、CellTiter-Glo?發光法和流式細胞儀分別檢測這2組細胞的存活比例、三磷酸腺苷（ATP）和活性氧（ROS）水平；以Gln（-）組為對照組，實驗組中加入草酰乙酸（OAA）或α-酮戊二酸二甲酯（DM-αKG），檢測各組H446細胞的ATP水平、增殖和存活情況；以Gln（-）組為對照組，實驗組中加入ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），檢測2組細胞的ROS水平、增殖、克隆和存活情況；在Gln（+）條件下，用0、2、5、10 μmol/L谷氨酰胺酶抑制劑BPTES處理H446細胞，通過克隆實驗篩選最佳作用濃度，在此濃度下檢測Gln（+）組和Gln（+）+BPTES組細胞的ATP、ROS水平和增殖水平。最后，單獨應用BPTES或ROS誘導劑過氧化氫（H2O2）和二者聯合應用情況下檢測細胞的存活比例。結果相比Gln（+）組，Gln（-）組H446細胞的增殖水平在24、48、72、96 h均降低（P＜0.05），72 h降低最明顯，取72 h為最佳時間；Gln（-）組細胞的存活比例和ATP水平低于Gln（+）組（P＜0.05），ROS水平高于Gln（+）組；相比Gln（-）組，Gln（-）+OAA組和Gln（-）+DM-αKG組H446細胞的ATP和增殖未升高，而存活比例升高（P＜0.05）；相比Gln（-）組，Gln（-）+NAC組ROS水平降低，增殖、克隆水平和存活比例均升高（均P＜0.05）。克隆實驗結果顯示10 μmol/L BPTES為最佳濃度；相比Gln（+）組，Gln（+）+BPTES組細胞的ATP和增殖降低（均P＜0.05），ROS水平升高；相比單獨應用，BPTES+H2O2組H446細胞存活比例明顯降低。結論Gln缺乏可通過提高ROS水平抑制H446細胞的增殖和生存；BPTES和H2O2對H446細胞有聯合殺傷作用。

谷氨酰胺；肺腫瘤；癌，小細胞；腺苷三磷酸；活性氧；細胞增殖；細胞存活

小細胞肺癌是肺癌中最具侵襲性的一種類型，占肺癌患者的10%～15%［1］，自1970年起小細胞肺癌的5年生存率一直維持在5%上下［2］。與正常細胞的代謝方式不同，大部分腫瘤細胞主要依賴有氧糖酵解產生所需的能量，這種現象被稱為“沃伯格效應”［3］。此外，有些癌細胞系如人骨髓瘤細胞對谷氨酰胺（Gln）也有較高的依賴性［4］。在非小細胞肺癌中，Gln通過各種途徑影響細胞的增殖、存活和藥物敏感性，但在小細胞肺癌中的作用及機制尚不清楚。本研究主要從能量生成和活性氧（ROS）兩方面探討Gln影響H446細胞的增殖和生存的機制，并用谷氨酰胺酶抑制劑BPTES［5］和ROS生成劑H2O2［6］處理H446細胞，觀察細胞增殖和存活情況，為小細胞肺癌的靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人小細胞肺癌細胞系H446購自美國菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 試劑和儀器RPMI-1640培養基、胎牛血清和胰酶購自Biological Industries公司；L-谷氨酰胺（L-Gln）、無Gln的RPMI-1640培養基購自美國Life technologies公司旗下Gibco?；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）購自阿拉丁公司；α-酮戊二酸二甲酯（DM-αKG）購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自東仁化學科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；CO2培養箱購自Thermo Forma公司；倒置顯微鏡購自Nikon ECLIPSE公司；恒溫孵育箱購自上海精宏實驗設備有限公司；低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養H446細胞用RPMI-1640培養基培養，內含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L，置于37℃，5%CO2孵育箱培養。

1.2.2 細胞增殖實驗根據CCK-8試劑盒操作步驟，取對數生長期H446細胞，以3×104個/mL接種于96孔板，邊緣用無菌PBS溶液填充，常規培養24 h后，將細胞分為2組，分別加入含Gln（Gln+）和不含Gln（Gln-）培養基，于0、24、48、72、96 h向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育1.5 h，在酶標儀450 nm波長下檢測光密度（OD）值，篩選出最佳時間。以Gln（-）組為對照組，在Gln（-）條件下，實驗組中分別加入草酰乙酸（OAA）、DM-αKG（其作用是為細胞提供αKG）或ROS清除劑NAC［7-8］，48 h后按CCK-8試劑盒操作步驟，用酶標儀檢測OD值。以Gln（+）組為對照組，在Gln（+）條件下，實驗組加入谷氨酰胺酶（GLS）抑制劑BPTES，48 h后同上方法用酶標儀檢測OD值。

1.2.3 三磷酸腺苷（ATP）檢測取對數生長期H446細胞，以1×105個/mL接種于6孔板中，常規培養24 h，細胞設Gln（-）、Gln（+）、Gln（-）+OAA、Gln（-）+DM-αKG、Gln（+）+ BPTES。根據1.2.2選取的最佳時間，按照CellTiter-Glo?試劑盒操作步驟，每組分別計數，調整細胞懸液密度為1×105個/mL，以每孔100 μL均勻接種于不透明96孔酶標板，背景孔只含有100 μL培養基，室溫平衡30 min后，向每孔中加入100μL CellTiter-Glo?試劑，振蕩混勻，室溫孵育10 min，使熒光信號穩定，記錄發光信號。

1.2.4 ROS檢測取對數生長期H446細胞，以4×104個/mL接種于12孔板中，常規培養24 h，細胞設Gln（-）、Gln（+）、Gln（-）+NAC、Gln（+）+BPTES。在1.2.2選取的最佳時間，按照1∶1 000比例用無血清培養基稀釋熒光素，使終濃度為10 μmol/L，每孔加入1 mL稀釋好的熒光素，陰性對照孔加入1 mL不含探針的無血清培養基。37℃培養箱孵育30 min，每隔5 min混勻1次，使探針與細胞充分作用，用PBS洗滌3次，將細胞重懸至EP管中離心，用200 μL PBS溶液重懸細胞，用流式細胞儀檢測ROS水平。

1.2.5 細胞凋亡實驗取對數生長期H446細胞，以8×104個/mL接種于12孔板，常規培養24 h，實驗分組同1.2.2，培養相應時間后收集細胞至離心管中，PBS洗滌2遍，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL的結合緩沖液重懸細胞，再加入5 μL異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和5 μL碘化丙啶（PI），混勻，室溫避光反應15 min，1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算存活比例；再以Gln（+）組為對照組，實驗組分別為BPTES組、H2O2組和BPTES+H2O2組，48 h后檢測細胞凋亡情況，計算其存活比例。

1.2.6 平板克隆形成實驗取對數生長期H446細胞，以1× 104個/mL接種于12孔板中，常規培養24 h后，加濃度梯度0、2、5、10 μmol/L的BPTES于培養基中，第7天，終止培養，用80%甲醇固定細胞，0.4%結晶紫進行染色，在倒置顯微鏡下計數5個視野中至少包含50個細胞的克隆數，取其平均值，篩選出BPTES的最佳作用濃度。以Gln（-）組為對照組，實驗組中加入NAC，第7天，同上計數克隆數量。

1.3 統計學方法采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較用單因素方差分析，多重比較用LSD-t法，所有實驗獨立重復至少3次，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 谷氨酰胺對H446細胞增殖和生存的影響相對于Gln（+）組，在24、48、72、96 h，Gln（-）組H446細胞的增殖能力均下降（P＜0.05），其中，在72 h Gln（-）組細胞的增殖水平下降59.1%，最為顯著。因此，取72 h為最佳時間。在72 h，相對于Gln（+）組，Gln（-）組細胞的存活比例下降17%（P＜0.05），見表1、2，圖1。

2.2 OAA和α-KG對H446細胞ATP水平、增殖和存活的影響在谷氨酰胺缺乏條件下細胞ATP水平下降16%（P＜0.05），加入OAA或DM-αKG后，ATP和增殖水平沒有得到恢復，加入OAA后存活比例升高約19%，加入DM-αKG后存活比例升高約13%（P＜0.05），見圖1，表2、3。

Tab.1 Comparison of the proliferation between two groups of cells表1 Gln（+）和Gln（-）組的細胞增殖能力的比較（n=6，OD450，）

Tab.1 Comparison of the proliferation between two groups of cells表1 Gln（+）和Gln（-）組的細胞增殖能力的比較（n=6，OD450，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別Gln（+）組Gln（-）組t 0 h 0.57±0.06 0.61±0.05 0.512 24 h 1.58±0.09 0.97±0.08 5.066＊＊48 h 2.31±0.13 1.19±0.12 6.331＊＊72 h 2.84±0.70 1.16±0.10 2.376＊96 h 1.71±0.05 0.89±0.09 7.965＊＊

Tab.2 Comparison of the survival and ATP level between two groups表2 Gln（+）和Gln（-）組的細胞存活能力和ATP水平的比較（n=5，）

Tab.2 Comparison of the survival and ATP level between two groups表2 Gln（+）和Gln（-）組的細胞存活能力和ATP水平的比較（n=5，）

＊＊P＜0.01

組別Gln（+）組Gln（-）組t存活比例（%）79.52±2.40 66.23±1.19 4.961＊＊ATP（μmol/L）1.01±0.02 0.85±0.02 5.657＊＊

2.3 NAC對H446細胞ROS水平、增殖、克隆和存活的影響谷氨酰胺缺乏條件下細胞中ROS水平升高，加入NAC后，ROS水平下降，細胞增殖水平升高25%（P＜0.05），克隆數量有較明顯的升高（P＜0.05），存活比例升高10%（P＜0.05），見圖1～3，表4。

Fig.1 Effects of of OAA,α-KG or NAC on cell survival圖1 OAA、α-KG或NAC對細胞存活的影響

Tab.3 Comparison of the proliferation,survival and ATP level between three groups表3 各組細胞增殖、存活能力和ATP水平的比較（n=5，）

Tab.3 Comparison of the proliferation,survival and ATP level between three groups表3 各組細胞增殖、存活能力和ATP水平的比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；t1、t2均與Gln（-）組比較

組別Gln（-）組Gln（-）+OAA組Gln（-）+DM-αKG組t1t2 ATP（μmol/L）0.85±0.02 0.86±0.02 0.81±0.02 0.144 1.516增殖（OD450）0.74±0.05 0.71±0.03 0.82±0.03 0.412 1.531存活比例（%）66.23±1.19 78.51±3.38 74.98±1.14 3.426＊＊5.313＊＊

2.4 不同濃度BPTES作用下H446細胞的克隆情況0、2、5、10 μmol/L BPTES作用下H446細胞克隆數量分別為26.88±1.87、25.50±1.67、19.75±2.02、17.88±1.69，差異有統計學意義（F=5.751，P＜0.01）。在2 μmol/L BPTES時克隆水平無明顯變化，5 μmol/L BPTES時開始出現下降，10 μmol/L BPTES時，明顯下降。以10 μmol/L BPTES為最佳實驗濃度。2.5BPTES對H446細胞的ATP、ROS水平和增殖水平的影響相對于Gln（+）組，Gln（+）+BPTES組細胞內ATP水平降低24%左右（P＜0.05），ROS水平升高，細胞增殖水平降低約16%（P＜0.05），見表5、圖4。

Fig.2 The effect of NAC on the cellular ROS level in H446 cells圖2 NAC對H446細胞內ROS水平的影響

Fig.3 The effect of NAC on cell colony(Crystal violet，×40）圖3 NAC對細胞克隆水平的影響（結晶紫染色，×40）

Tab.4 Comparison of the proliferation,colony and survival between two groups表4 各組細胞增殖、克隆和存活能力的比較（n=5，）

Tab.4 Comparison of the proliferation,colony and survival between two groups表4 各組細胞增殖、克隆和存活能力的比較（n=5，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別Gln（-）組Gln（-）+NAC組t增殖（OD450）0.65±0.04 0.81±0.03 3.051＊克隆（個）6.20±0.73 22.60±0.68 16.400＊＊存活比例（%）67.63±0.64 74.43±0.58 7.882＊＊

Tab.5 Comparison of cell proliferation and ATP level between two groups表5 2組細胞的ATP和增殖能力的比較（n=5）

Tab.5 Comparison of cell proliferation and ATP level between two groups表5 2組細胞的ATP和增殖能力的比較（n=5）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別Gln（+）Gln（+）+BPTES t ATP（μmol/L）0.99±0.03 0.75±0.01 8.099＊＊增殖（OD450）0.58±0.02 0.51±0.02 2.308＊

2.6 單獨應用BPTES或H2O2和聯合應用情況下細胞的存活情況相對于對照組，單獨應用BPTES或H2O2，細胞存活比例有所下降，聯合應用時細胞存活比例有較明顯的降低，見圖5。

Fig.4 The effect of BPTES on the cellular ROS level圖4 BPTES對細胞內ROS水平的影響

Fig.5 The survival ratio of H446 cells treated with BPTES, H2O2or the combination of them圖5 單獨應用BPTES或H2O2和聯合應用情況下細胞的存活比例

3 討論

Gln參與細胞生長的多個環節，例如能量生成、提供氮源、合成抗氧化物質維持氧化還原平衡狀態等。有研究指出在非小細胞肺癌中，Gln促進谷胱甘肽的合成，影響細胞增殖和放療敏感性［9］，抑制Gln代謝可以增加細胞對某些藥物如厄羅替尼［10］以及芹菜素［11］的敏感性，從而促進細胞凋亡。但Gln在小細胞肺癌中的作用目前尚不清楚。

本實驗結果顯示，Gln缺乏抑制H446細胞的增殖和生存。相對于Gln（+）組，Gln缺乏條件下細胞中ATP水平降低。有研究表明，在Ras突變導致的癌細胞中，Gln參與三羧酸循環回補過程［12］。而本實驗中，在Gln缺乏條件下加入三羧酸循環中間產物OAA或α-KG后，發現H446細胞中ATP水平和增殖水平并沒有得到恢復，提示H446細胞中Gln不通過三羧酸循環回補途徑影響細胞增殖，推測可能通過糖異生或者其他途徑影響細胞增殖。但是加入三羧酸循環中間產物OAA或α-KG后存活比例升高，其原因目前尚不清楚。此外，相關研究指出，Gln不僅參與細胞的能量生成，還作為谷胱甘肽的前體，參與自由基清除，維持氧化還原平衡［13］。本研究結果顯示，Gln缺乏條件下細胞中ROS水平升高，加入NAC后，ROS水平下降，增殖、克隆水平和存活比例都有不同程度的恢復，提示Gln缺乏可通過提高ROS水平影響細胞增殖和生存。GLS可使Gln轉化為谷氨酸，其在哺乳類細胞中有2種類型：GLS1和GLS2，其中，GLS1在癌癥發生過程中有重要作用。在本實驗中，結果顯示BPTES抑制H446細胞的增殖和存活。目前，也有其他研究表明，在前列腺癌和肝細胞癌組織中，GLS1的表達水平高于正常組織，BPTES作為GLS1的特異性抑制劑，可抑制一些腫瘤的生長［14］。本實驗結合臨床上常用的放療手段和放療原理，選擇用H2O2來模擬放療［15-16］，結果顯示相對于單獨用BPTES或H2O2，聯合應用BPTES和H2O2可以更有效地抑制細胞的生存，推測Gln代謝的抑制可以增強放療敏感性。

綜上所述，Gln缺乏可通過增高ROS水平抑制小細胞肺癌H446細胞的增殖和生存，聯合應用GLS抑制劑BPTES和H2O2可有效抑制H446細胞的生長。但其中可能還存在其他相關的作用機制，需待進一步深入研究。

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（2016-06-26收稿 2016-10-26修回）

（本文編輯 李國琪）

Glutamine regulates the proliferation and survival of small cell lung cancer H446 cells

XU Pengyu,LI Jiayin,MIAO Yajing,GAO Cuicui,SHEN Yao,JIN Fang,QIU Xiaofei△
Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China△

ObjectiveTo investigate the effects of glutamine(Gln)on proliferation and survival of small cell lung cancer H446 cells,and further to explore the potential mechanism.MethodsThe proliferation of H446 cells was detected at different time points(0,24,48,72 and 96 h)by CCK-8 assay in Gln(+)group and Gln(-)group,and an optimal time was selected.Under the optimal time,Annexin V-FITC/PI staining,CellTiter-Glo?assay kit and flow cytometer were used to detect cell survival,cellular adenosine triphosphate(ATP)and reactive oxygen species(ROS)levels.Gln(-)group was used as the control group,under the condition of Gln deficiency,cellular ATP,cell proliferation and survival were detected after adding oxaloacetic acid(OAA)or dimethyl-α-ketoglutarate(DM-αKG).Gln(-)group was used as the control group, cellular ROS,cell proliferation,colony and survival were detected after treated with ROS scavenger N-acetyl cysteine (NAC).With different concentrations(0,2,5,10 μmol/L)of glutaminase inhibitor BPTES,the optimal concentration was selected through the colony assay.The cellular ATP and ROS levels and cell proliferation were detected under the optimal concentration.H446 cells were treated with bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide(BPTES),ROS inducer hydrogen peroxide(H2O2)or the combination of them,and cell survival ratio was compared between two groups.ResultsThe proliferation levels of H446 cells at 24,48,which were decreased most significantly in 72 h in Gln(-)group. When 72 h was used as the optimal time,the cell survival ratio and ATP level were decreased,and the ROS level was increased,in Gln(-)group compared with those of Gln(+)group(P＜0.05).There was a higher survival ratio in H446 cellsin Gln(-)+OAA group and Gln(-)+DM-αKG group than that of Gln(-)group(P＜0.05),but there were no significant differences in cell proliferation and ATP levels between Gln(-)group,Gln(-)+OAA group and Gln(-)+DM-αKG group. The ROS level was reduced,the cell proliferation,colony level and survival ratio were increased in Gln(-)+NAC group compared with those of Gln(-)group(P＜0.05).Cloning assay showed that 10 μmol/L was the optional concentration.Under this concentration,the proliferation and ATP level were decreased in Gln(+)+BPTES group(P＜0.05),and cellular ROS level was up-regulated compared with Gln(+)group.The survival ratio was significantly lower in BPTES+H2O2group compared with BPTES(+)group or H2O2(+)group.ConclusionGlutamine deficiency inhibits the proliferation and survival ratio of H446 cells through enhancing ROS level.BPTES and H2O2show synergistically inhibitory effect on the survival of H446 cells.

glutamine;lung neoplasms;carcinoma,small cell;adenosine triphosphate;reactive oxygen species;cell proliferation;cell survival

R734.2

A

10.11958/20160592

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃重點項目（14JCZDJC35500）

天津醫科大學（郵編300070）

徐鵬育（1991），女，碩士在讀，主要從事腫瘤分子病理學研究

△通訊作者E-mail:qiouxf@tijmu.edu.cn