代謝工程改造Corynebacteriumglutamicum生產L-蘋果酸

趙一，李天明，劉金雷，王崇慧，儀宏，馮惠勇

(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊,050000)

代謝工程改造Corynebacteriumglutamicum生產L-蘋果酸

趙一，李天明，劉金雷，王崇慧，儀宏，馮惠勇*

(河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊,050000)

以提高L-蘋果酸的產量為目標，采用一次交換兩次同源重組的方法，利用反向篩選標記，在敲除了丙酮酸醌氧化還原酶編碼基因(pqo),丙酮酸脫氫酶編碼基因(pdh)和乳酸脫氫酶編碼基因(lldh)的C. glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C. glutamicumΔPPL)基礎上，無痕敲除了L-蘋果酸積累支流代謝途徑的2個關鍵酶基因：蘋果酸醌氧化還原酶編碼基因(mqo)和蘋果酸酶編碼基因(male)，同時敲入了蘋果酸分泌轉運蛋白基因(transb)，獲得了產L-蘋果酸的工程菌株；采用高效液相色譜法檢測了工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的發酵產物。實驗結果表明：C. glutamicum ATCC 13032發酵后不積累L-蘋果酸，而工程菌C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale發酵48 h，積累了12.8 g/L的L-蘋果酸，工程菌的糖酸轉化率為33.18%，為利用C. glutamicum ATCC 13032發酵生產L-蘋果酸提供了基礎遺傳資源。

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)；L-蘋果酸；基因敲除；基因敲入

L-蘋果酸是一種十分重要的有機酸, 在食品、醫藥等工業中有著廣泛的應用。L-蘋果酸可用作食品添加劑，具有抑菌防腐的作用,可延長香腸和果醬的保存期[1]；在葡萄酒釀造中用于除去酒石酸鹽[2]；作為日化品添加劑,能夠起到潤膚和抗皺作用[3]；醫藥行業中，在抗疲勞、治療心臟病、保護肝臟等方面有明顯的作用[4]。

L-蘋果酸的生產主要有化學合成法、酶催化法和微生物法[5]。化學合成法是利用順丁烯二酸為原料經過兩個步驟合成L-蘋果酸，此方法存在污染環境，技術復雜，產物不純等缺點[6]。第二種是酶催化法，以富馬酸鹽為原料，利用微生物的延胡索酸酶催化生成L-蘋果酸，但此方法成本較高，產業化應用受到限制[7-9]。目前工業上有多種微生物法能夠發酵生產L-蘋果酸，如利用黃曲霉(Aspergillus flavus ATCC13697)以葡萄糖為原料，一步發酵生產蘋果酸[10-13]；也可以2種微生物聯合應用生產L-蘋果酸,如先利用少根根霉菌(Rhizopusahirrizus)將糖質類原料發酵成富馬酸，再用膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)將富馬酸轉化為L-蘋果酸[14-16]。與化學合成法和酶催化法相比,微生物轉化法效率更高、能耗更低,而且清潔環保。

Corynebacterium.glutamicum是經典食品性安全菌，而且近年來，C. glutamicum ATCC 13032全基因組測序的完成和C. glutamicum ATCC 13032的遺傳操作系統的完善，都為利用代謝工程手段對其進行定向改造提供了有利條件，使得C. glutamicum ATCC 13032作為細胞工廠，越來越廣泛地應用于化學品的生物制造[17-20]，因此用C. glutamicum ATCC 13032發酵生產L-蘋果酸具有一定的理論及應用價值。C. glutamicum ATCC 13032積累L-蘋果酸的代謝途徑如圖1所示。

圖1 C. glutamicum ATCC 13032部分代謝途徑Fig.1 The partial metabolic pathways of C. glutamicum ATCC 13032

通過阻斷乙酸和乳酸形成途徑，提高丙酮酸的合成，以增加L-蘋果酸合成的底物；通過阻斷TCA循環途徑中由L-蘋果酸到草酰乙酸的代謝途徑，大量積累L-蘋果酸，使其接近1 mol葡萄糖生成1 molL-蘋果酸的最大理論摩爾收率，獲得具有工業應用價值、優良性能的工程菌。

本研究以實驗室保存菌株C. glutamicum ΔPPL(實驗室保存菌株)作為出發菌株，即敲除了丙酮酸醌氧化還原酶基因(pqo),丙酮酸脫氫酶基因(pdh)和乳酸脫氫酶基因(lldh)的工程菌，利用同源重組的原理及蔗糖致死基因(sacB基因)的反向篩選，無痕敲除了控制丙酮酸和L-蘋果酸代謝過程中的支流代謝途徑的關鍵基因：蘋果酸酶編碼基因(mqo)和蘋果酸醌氧化還原酶編碼基因(male)，同時強化了L-蘋果酸分泌轉運蛋白基因(transb)，獲得了產L-蘋果酸的工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

本實驗所用質粒與菌株見表1。

表1 本研究所用的菌株和質粒

1.1.2 試劑

High-Fidelity DNA 聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶均購自NEB公司；T4DNA ligse購自大連寶生物工程公司；DNA分子量標準購自大連寶生物工程公司(TARAKA)；基因組提取試劑盒、質粒小提中量試劑盒、超薄DNA產物純化試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其他試劑均為分析純產品，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養基和菌株培養條件

LB培養基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，調pH值6.5左右，需要時加入卡那霉素至終濃度30 mg/L。固體培養基則添加瓊脂粉20 g/L。

CD培養基：1 g/LKH2PO4，3 g/L (NH4)2SO4，1 g/L NH4NO3，0.5 g/L MgSO4，0.2 g/L CaCl2，0.01 g/L Fe2(SO4)3，0.01 g/L MnSO4，0.002 g/L CuSO4，0.001 g/L ZnSO4，0.002 g/L生物素，pH值6.5左右。

轉化培養基：CD培養基，25 g/L葡萄糖，5 g/L NaAce，pH值6.5左右。

種子培養基和發酵培養基：50 g/L葡萄糖，10 g/L NaAce，3 g/L (NH4)2SO4，1.5 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O，5 g/L (NH4)2SO4，0.2 g/L CaCl2，pH 7.0。

C.glutamicumATCC 13032 在30 ℃、160 r/min條件下培養，E.coliDH5α在37 ℃、160 r/min條件下培養。

1.1.4 儀器與設備

PCR擴增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動凝膠成像系統，Bio-Rad Molecular Imager Gel DOC XR；臺式高速離心機，Eppendorf Mini Spin；高速冷凍離心機，Thermo Sorvall Evolution RC；酶標儀，Bioteke Powerwave；高效液相色譜儀，Agilent 1260 Infinity。

1.2 方法

1.2.1 打靶質粒的構建

mqo基因敲除質粒構建方法為：分別以C.glutamicum ATCC 13032和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因組作為模板，利用PCR擴增出待敲除基因mqo的上下游同源臂片段和待敲入的替換基因transb，利用融合PCR技術擴增獲得目的片段mqoup-transb-do，純化后與pK18mobsacB空質粒用Hind III和Not I進行雙酶切反應，得到酶切產物，通過T4連接酶16 ℃過夜連接，并轉化到E.coli DH5α感受態細胞中，通過驗證獲得打靶質粒pK18mobsacB/Δmqo::transb。同樣，利用此方法構建獲得male基因敲除質粒pK18mobsacB/Δmale，本實驗所用引物如表2所示，下劃線部分為酶切位點序列。

表2 本實驗所用引物

1.2.2 感受態及電轉化方法

大腸感受態制備參見《分子克隆實驗指南》[21]，谷氨酸棒狀桿菌電轉化感受態的制備參考《Handbook ofCorynebacteriumglutamicum》[22]。

1.2.3 工程菌株的轉化

谷氨酸棒桿菌工程菌株的構建是利用負篩選標記通過2次同源重組的方法進行基因敲除來實現的，如圖2所示。

圖2 同源雙交換原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of homologous double switch

以獲得突變菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transb為例，首先將pK18mobsacB/Δmqo::transb經電轉化(電擊條件為，2.5 kV/cm電壓，250 Ω電阻，25 μF電容，2 mm 電擊杯)轉入到工程菌C. glutamicumΔPPL感受態細胞中，經過電轉的細胞再在含有0.5%乙酸鈉的液體LB培養基中30 ℃恒溫培養3 h，再把發酵液涂布在含有30 μg/mL卡那霉素及0.5%乙酸鈉的LB固體培養基30 ℃恒溫培養48～60 h。

1.2.4 陽性轉化子的鑒定

經菌落PCR驗證篩選出第1次同源重組的工程菌，即pK18mobsacB/Δmqo::transb經同源重組已整合到染色體上。再將其接到含有0.5%乙酸鈉的液體LB培養基中，在30 ℃恒溫搖床中培養12 h后，涂布在含有10%蔗糖的LB固體培養基上，利用蔗糖致死基因sacB基因負篩選出第2次同源重組的轉化子，將其一一對應分別擴培到含10%蔗糖和30 μg/mL Kan抗性且含有0.5%乙酸鈉的LB固體培養基中，培養1 d左右。最后挑選在蔗糖板上生長而Kan板上不生長的菌落，利用菌落PCR驗證篩選出陽性工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transb。利用此方法將pK18mobsacB/Δmale轉入C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb中，獲得C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale。1.2.5 工程菌株生長及發酵L-蘋果酸的研究

將驗證正確的工程菌C. glutamicumΔPPLmqo::transb、C.glutamicumΔPPLmqo::transbΔmale和野生型菌株C. glutamicum ATCC 13032分別接種到含5%葡萄糖和1%乙酸鈉的CD液體培養基中作種子，30 ℃、180 r/min過夜培養，培養物離心收集菌體，轉移到以5%的葡萄糖1%乙酸鈉作為碳源的CD培養基中，以相同條件繼續搖床振蕩培養，發酵48 h，整個發酵過程中定時調節pH，使之維持在7.0，同時測定OD值，定期記錄菌株生長情況，并留存樣品用來進行高效液相色譜的測定。

1.2.6 高效液相色譜檢測丙酮酸和L-蘋果酸的方法

將待測發酵液經轉速10 000 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm 醋酸纖維素濾膜過濾后，利用高效液相色譜法分析L-蘋果酸的含量[23]。檢測條件為:Agilent1200高效液相色譜儀，紫外檢測器，BDS HYPERSIL C18柱，4.6 mm×200 mm，流動相：乙腈和20 mmol/L KH2PO4(pH2.8)混合液(體積比為1∶99)，流速0.5 mL/min。檢測波長210 nm，柱溫29 ℃，進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1mqo基因缺失菌株的構建及驗證

2.1.1mqo基因敲除打靶質粒的構建

蘋果酸醌氧化還原酶基因(mqo)是以野生型C. glutamicum ATCC 13032基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得mqo基因的上下同源臂；再以Saccharomyces cerevisiae的基因組為模版，擴增出強化分泌的transb基因，融合獲得大小為3 400 bp的片段mqoup-transb-do，如圖3-A所示。將融合片段與空質粒pK18mobsacB相連，得到重組質粒pK18mobsacB/Δmqo::transb，對其進行雙酶切驗證，如圖3-B所示，經酶切后的質粒分別獲得大小為3 400 bp的融合片段和5 400 bp載體片段，符合與理論值一致，說明mqo基因敲除打靶質粒的構建成功。

A:1,2-mqo基因上下同源臂transb融合結果；M-DNA 5k marker; B：1-pK18mobsacB/Δmqo::transb雙酶切；2-pK18mobsacB空質粒雙酶切；M-DNA 15k marker圖3 pK18mobsacB/Δmqo::transb打靶質粒的構建Fig.3 Construction of targeting plasmid pK18mobsacB/Δmqo::transb

2.1.2 工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb的篩選及驗證

將重組質粒pK18mobsacB/Δmqo::transb電轉化至實驗室前期構建的工程菌C. glutamicumΔPPL感受態細胞中，通過兩次同源重組使transb基因替換mqo基因，從而mqo基因被敲除。按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因mqo的基因序列設計敲除驗證引物QMQOF/QMQOR，隨機挑取7株重組菌株，分別利用mqo基因敲除驗證引物QMQOF/QMQOR、transb基因驗證引物TRANSF/TRANSR進行菌落PCR驗證，結果如圖4所示，7號菌株擴增出1 000 bp的transb基因，而mqo基因未能擴增處，這說明7號菌株transb基因整合到了染色體，替換掉了mqo基因，從而獲得了工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb。

T1-7：transb基因驗證結果；M1-7：mqo基因驗證結果；+：陽性對照；-：陰性對照；M：DNA 2k marker圖4 工程菌C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb菌落PCR驗證Fig.4 Colony PCR verification of C. glutamicum ΔPPL Δmqo::transb

2.2male基因缺失菌株的構建及驗證

2.2.1male基因敲除打靶質粒的構建

A:1～3-male基因上下同源臂融合結果；M-DNA 2k marker;B：1-pK18mobsacB/Δmale雙酶切；2-pK18mobsacB空質粒雙酶切；M-DNA 15k marker圖5 pK18mobsacB/Δmale打靶質粒的構建Fig.5 Construction of targeting plasmid pK18mobsacB/Δ mqo::transb

蘋果酸酶基因(male)是以野生型C. glutamicum ATCC 13032基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得上下同源臂，經融合獲得大小為1 900 bp的片段maleup-do，結果如圖5-A。將融合片段與空質粒pK18mobsacB相連，得到重組質粒pK18mobsacB/Δmale，對其進行雙酶切驗證，如圖5-B所示，經酶切后的質粒分別獲得大小為1 900 bp的融合片段和5 400 bp載體片段，符合與理論值一致，說明male基因敲除打靶質粒的構建成功。2.2.2 工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的構建

將重組質粒pK18mobsacB/Δmale電轉化至工程菌C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb的感受態細胞中，通過2次重組使male基因被敲除。按照按照C. glutamicum ATCC 13032基因組序列中待敲除基因male的基因序列設計敲除驗證引物QMALEF/QMALER，隨機挑取7株重組菌株，利用male基因敲除驗證引物QMALEF/QMALER進行菌落PCR驗證，結果如圖6所示，2-5號菌株未能擴增出male基因，而陽性對照C. glutamicumΔPPLΔmqo::transb與其他菌株擴增出了male基因，陰性對照水為模版也同樣未能擴增處條帶，這說明2-5號菌株male基因被敲除，從而驗證了工程菌株C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale構建成功。

M1-10：male基因驗證結果；+：陽性對照；-：陰性對照；M：DNA 2k marker圖6 工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale菌落驗證 Fig.6 Colony PCR verification of C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale

2.3 工程菌生長特性研究

將C.glutamicumΔPPL，C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale與野生菌C. glutamicum ATCC 13032以等OD值分別接種到含5%葡萄糖和1%乙酸鈉的CD培養基中，在30℃、160 r/min條件下培養，分別在12、24、36、48 h測定OD值，繪制生長狀況圖，如圖7所示。由于基因缺失C. glutamicumΔPPL、C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的生長情況均不如野生型C. glutamicum ATCC 13032。與野生型C.glutamicum ATCC 13032相比，基因缺失菌株C.glutamicumΔPPL和C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale生長較緩慢，而且其生長依賴于乙酸鹽，是因為兩株工程菌株都缺失了pdh基因造成的。

圖7 生長曲線圖Fig.7 Growth curve

2.4 工程菌的L-蘋果酸產量

為了進一步驗證工程菌L-蘋果酸的產量,分別將C.glutamicumΔPPL、C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale與野生菌C.glutamicum ATCC 13032同時以5%的葡萄糖和1%乙酸鈉作為碳源的CD培養基進行搖瓶發酵，48 h后收集發酵液，利用高效液相色譜法測定發酵液中L-蘋果酸的含量同時測定副產物丙酮酸的含量。由于工程菌 C. glutamicumΔPPL Δmqo::transbΔmale敲除了蘋果酸代謝過程中的2個關鍵基因蘋果酸醌氧化還原酶編碼基因(mqo)和蘋果酸酶編碼基因(male)，遏制了副產物的形成，且強化了蘋果酸分泌基因(transb),因而積累的L-蘋果酸明顯高于野生型菌株和出發菌株。經計算結果表3所示。野生型菌株C. glutamicum ATCC 13032 發酵48小時后，沒有L-蘋果酸積累，丙酮酸的含量為0.65 g/L，而工程菌C.glutamicumΔPPL在敲除pqo,pdh, lldh后，丙酮酸含量提高為15.1 g/L、L-蘋果酸含量為0 g/L，C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale發酵48小時后L-蘋果酸的含量為12.8 g/L、丙酮酸含量為14.6 g/L，L-蘋果酸含量明顯提升，丙酮酸含量略有下降，出峰結果如圖8所示。

圖8 工程菌C. glutamicum ΔPPLΔmqo::transb Δmale發酵48 h液相圖Fig.8 C. glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale 48 h fermentation phase diagram

3 結論

本文采用食品級微生物C.glutamicum作為L-蘋果酸的生產菌，更安全可靠，符合食品添加劑的生產要求[24-25]。根據C.glutamicum的L-蘋果酸生物合成的代謝途徑，設計代謝工程改造的策略(如圖1所示)，在敲除了支流代謝相關酶編碼基因基礎上，依次構建了蘋果酸轉運蛋白酶編碼基因(transb)置換蘋果酸醌氧化還原酶編碼基因(mqo)的打靶質粒pK18mobsacB/Δmqo::transb和敲除蘋果酸酶基因(male)的打靶質粒pK18mobsacB/Δmale，通過電擊轉化，將打靶質粒pK18mobsacB/Δmqo::transb和pK18mobsacB/Δmale依次轉化至已制備好的相應的感受態細胞中，通過一次交換兩次同源重組的方法，經抗性篩選和反向標記篩選，獲得陽性轉化子，經PCR驗證，證明C.glutamicumΔPPL染色體上的mqo,male基因被敲除，transb基因被敲入，獲得C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale工程菌株。在5%的葡萄糖1%乙酸為碳源的CD培養基中，進行搖瓶發酵，48 h后，野生菌株無L-蘋果酸產生，而工程菌L-蘋果酸的產量為12.8 g/L，工程菌的糖酸轉化率為33.18%。有效地阻斷了支流代謝途徑，減少了副產物的生成，強化了L-蘋果酸的分泌，提高了L-蘋果酸的產率。獲得的遺傳資源具有產業化應用潛力，為進一步代謝工程改造菌種、提高L-蘋果酸產量奠定了基礎。

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Metabolic engineering ofCorynebacteriumglutamicumforL-malate production

ZHAO Yi, LE Tian-ming, LIU Jin-lei, WANG Chong-hui, YI YONG, FENG Hui-yong*

(College of Bioscience & Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050000,China)

L-malate is an important organic acid in microbial metabolic pathway. It has been widely used in food, medicine and other industrial fields. To improve malate production, the C. glutamicum ΔpqoΔpdhΔlldh(C. glutamicum PPL) was genetically modified by homologous recombination technology and reverse selection method to knockout pyruvate quinone oxidoreductase (pqo), pyruvate dehydrogenase (pdh) andL-lactate dehydrogenase (lldh). The 2 key genes in malate metabolic pathway, malate quinone oxidoreductase (mqo) and malic enzyme (male), were knockout and one new gene malate transport-protein (transb) was inserted intoC.glutamicumΔPPL to obtain a new engineering mutantC.glutamicumΔPPL Δmqo::transbΔmale. TheL-malate production was measured by HPLC after fermentation for 48 h. The results showed that theL-malate production from fermentation broth of mutant was 12.8 g/L whereas the wild type had noL-malate accumulation. The sugar acid conversion rate of engineering bacteria was 33.18%. Our research provides the genetic resources for malate production byC.glutamicumfermentation.

Corynebacteriumglutamicum;L-malate;knockout;knockin

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612003

碩士研究生(馮惠勇教授為通訊作者，E-mail：fenghuiyong@163.com)。

國家高技術研究發展計劃(2014AA022102)

2016-05-20，改回日期：2016-07-18