基于超聲波誘導孢子萌發與糖化酶活力表征移種策略高效合成檸檬酸

王寶石, 陳堅,2, 孫福新, 龐海強, 李由然, 張梁, 丁重陽, 顧正華, 石貴陽*

1(江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫， 214122)2(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122)3(江蘇國信協聯能源有限公司，江蘇 宜興，214200) 4(山東省費縣檢驗檢測中心，山東 費縣，273400)

基于超聲波誘導孢子萌發與糖化酶活力表征移種策略高效合成檸檬酸

王寶石1, 陳堅1,2, 孫福新3, 龐海強4, 李由然1, 張梁1, 丁重陽1, 顧正華1, 石貴陽1*

1(江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫， 214122)2(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122)3(江蘇國信協聯能源有限公司，江蘇 宜興，214200) 4(山東省費縣檢驗檢測中心，山東 費縣，273400)

檸檬酸作為最成熟的平臺化合物，近年來在新型行業的應用需求呈現出逐漸增長的趨勢，實現其高效生產具有重要的現實意義。針對檸檬酸傳統發酵方式中存在的種子培養前期延滯期長與發酵菌種活力波動大的缺陷，采用超聲波預處理黑曲霉孢子120 s，誘發孢子級聯反應而活化孢子，提高種子活力，縮短種子培養時間1.5 h，發酵效率提升8.13%；發酵罐水平系統研究種子整個生命周期中的關鍵指標變化規律，發現自身分泌的糖化酶能夠直觀反映細胞活力，以此為移種標準，契合檸檬酸同步糖化發酵的特點。集成超聲波誘導孢子萌發與糖化酶活力表征移種的策略，獲得高活力發酵菌種，總發酵時間縮短7.9 h，發酵產率提升11.76%，實現了檸檬酸高效合成。研究結果同時對于絲狀真菌或類似微生物為主體的發酵過程具有良好借鑒意義。

超聲波誘導；黑曲霉孢子；同步糖化發酵；檸檬酸；糖化酶

檸檬酸(citric acid)又名枸櫞酸，是一種重要的、多功能的有機酸，廣泛應用于食品、醫藥，化工等領域[1-3]；同時檸檬酸是最成熟的平臺化合物，伴隨著生物聚合、藥物運輸、 細胞培養等新興產業領域的廣泛應用[4-5]，現每年以5%的速度增長，是世界第二大發酵產品，產量僅次于酒精[6]；因而，檸檬酸的發酵生產一直是學者關注的熱點[7-8]。

黑曲霉由于酶系豐富，發酵效率高、副產物少等優勢，是檸檬酸生產最重要的發酵菌種[9-10]。發酵法生產檸檬酸研究方向主要集中在廉價原料開發[11-13]，發酵過程菌絲體形態控制[14-16]，新型發酵模式探索[2, 12, 17]等方面，而關于發酵罐中黑曲霉整個生命周期中生長規律及高活力種子培養方法卻鮮有報道[15]。黑曲霉屬產孢微生物，孢子萌發是絲狀真菌整個生命周期的關鍵步驟[18]，是啟動發酵過程的重要元件[19]，它會顯著影響種子生長與活力[20-22]；孢子萌發過程包括孢子活化與腫脹發芽兩個階段，它是對變換環境條件的生理性應答[23]。在種子培養過程的前期，孢子萌發需要較長的延滯期，從而延長了種子培養時間，尤其是在工業化生產中，增加了發酵設備運行時間，提高了運行成本。成熟種子轉接時機也是影響發酵的重要因素，而在現有發酵過程中，移種時機選擇多帶有經驗性，往往依據搖瓶培養優化的參數，仍然以種齡作為移種時機的關鍵指標[24-25]；種子培養過程的動態性與復雜性引起的發酵菌種活力波動大而難以滿足實際生產需求，往往會引起發酵過程波動，進而影響發酵效率。如何縮短孢子萌發時間，培養高活力的種子，選擇合適移種時機對于提高檸檬酸發酵效率至關重要。

本研究基于絲狀真菌孢子萌發的生理性特點，提出超聲波激活孢子，誘發孢子萌發級聯反應，縮短種子培養周期，提高種子活力；在發酵罐中培養黑曲霉種子，系統研究黑曲霉整個生命周期中的特征生理參數變化規律，同時基于檸檬酸淀粉質粗料發酵模式與同步糖化發酵(simultaneous saccharification and fermentation，SSF)的特點，提出以種子糖化酶活力表征的移種策略。組合超聲波預處理誘導孢子快速萌發培養種子與種子糖化酶活力表征的移種策略，縮短種子培養時間，提高了種子活力，實現檸檬酸的高效合成。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

1.1.1 菌種

黑曲霉H 915(Aspergillusniger，檸檬酸生產菌株)。

1.1.2 培養基

斜面培養基：PDA培養基。

玉米粉液化過程：玉米粉與水按照1∶3質量比混合均勻，調節pH至5.8～6.0，添加耐高溫α-淀粉酶30 U/g玉米粉，90 ℃保溫，并不斷攪拌均勻，至碘試合格為止，得玉米液化混液；液化混液經布氏漏斗抽濾，得液化清液。

種子培養基：玉米液化混液，添加硫酸銨與水按照一定的比例混合，調節總糖11%～12%，總氮0.23%～0.25%。

發酵培養基：玉米液化清液、玉米液化混液與水按照一定的比例混合，調節總糖16%～16.5%，總氮0.08%～0.09%。

1.2 儀器與設備

高轉速搖床，江蘇太倉市強樂實驗設備有限公司；恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；紫外及可見光分光光度計UV2450，日本Shimazu公司；高效液相色譜系統及工作站，美國戴安公司；臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；24-L發酵罐，江南大學自動化研究所與浙江新昌德力石化設備有限公司聯合研制；凱式定氮儀+凱式消化爐UDK159，意大利VELP。

1.3 培養方法

菌種活化及保存：將保藏的黑曲霉孢子轉接至茄子瓶，37 ℃恒溫培養箱倒置培養7 d，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

孢子懸液制備：用無菌水洗下孢子，用玻璃珠打撒孢子，用血球計數板計數。

超聲波預處理孢子：將制備的濃度為4×105個/mL黑曲霉孢子懸液置于超聲波清洗儀中超聲處理120 s，立即接種種子培養基。

搖瓶發酵培養：250 mL搖瓶，裝液量40 mL，培養溫度37 ℃，搖床轉速320 r/min，培養72 h結束發酵檢測。

24L發酵罐種子培養：黑曲霉孢子懸液以濃度4×105個/mL接種，裝液量18 L，培養溫度37 ℃，轉速與DO偶聯將DO控制在40%。

24L發酵罐發酵培養：成熟種子液接種量10%(v/v)，裝液量18 L，培養溫度37 ℃，轉速與DO偶聯將DO控制在50%。

1.4 檢測方法

發酵液離心(10 000×g，4 ℃，10 min)，發酵液上清用于檢測殘總糖、殘還原糖、糖化酶活力與檸檬酸，菌絲球用去離子水清洗3遍，105 ℃烘至恒重，測定生物量。殘總糖與還原糖采用菲林法測定；糖化酶活力采用GB 8276—2006；檸檬酸含量采用HPLC測定(Shodex SUGAR SH1011柱子 (6 μm×300 mm×8 mm)，紫外檢測，210 nm，0.005 mol/L稀硫酸)，重復3次實驗。

2 結果與分析

2.1 超聲波預處理孢子對種子生長與檸檬酸產量的影響

表1可以看出，策略A溶解氧開始下降時間為9±0.3 h，急劇下降時間為12±0.6 h；策略B溶解氧開始下降時間為7.5±0.3 h，急劇下降時間為10.5±0.5 h。孢子經超聲波處理后，DO開始下降與急劇下降時間分別縮短了16.7%，12.5%，縮短了種子前期較長的延滯期，從而縮短種子培養時間，同時提升了最大菌體量，這可能是由于孢子經超聲波處理后，激活孢子受體，啟動孢子系列反應[18,26]。為了評估超聲波預處理培養的種子對檸檬酸產量的影響，將培養的種子液以10%(v/v)接種量分別接種到24 L發酵罐進行發酵實驗，結果如表1所示。從表1可以看出，孢子經預處理后，檸檬酸產量增加，殘總糖降低；發酵周期縮短4 h，檸檬酸產率分別提高了8.13%。同時，發酵總時間(包括種子培養時間與發酵時間)縮短了5.5 h，提高了檸檬酸發酵效率。表明孢子經過超聲波預處理不僅縮短了種子培養時間，同時提高了發酵種子活力。

表1 黑曲霉孢子超聲波預處理對種子生長和檸檬酸發酵的影響

模式A：直接接種孢子為對照組；模式B：孢子超聲波預處理120 s為實驗組。

2.2 發酵罐培養的黑曲霉種子生理特性及生長動力學

黑曲霉孢子懸液以濃度4×105個/mL接種至24 L發酵罐，系統考察種子整個生命周期中生理參數變化規律，結果如圖1所示。圖1可以看出，0～8 h，總糖與還原糖含量基本不變，此階段孢子處于休眠調整期，逐漸吸水膨脹，為孢子萌發作充分準備；8 h開始孢子逐漸萌發，此階段因自身未分泌糖化酶不能生成還原糖，還原糖含量開始明顯下降；12 h開始，孢子已完全萌發并逐漸生長形成菌絲，總糖含量開始急劇下降，伴隨自身分泌的糖化酶活力增加，還原糖含量開始上升。糖化酶活力呈現先升高后下降的趨勢，在24 h時，糖化酶活力達到最高；還原糖含量也呈現類似的變化趨勢，24 h開始，還原糖生成速度遠低于消耗速度，還原糖含量直線下降。從檸檬酸產物變化曲線可以看出，16 h開始，檸檬酸產量明顯增加，呈直線上升趨勢，28 h檸檬酸合成速率放緩；pH變化曲線看出，培養8 h開始，培養液pH急劇下降，16 h 開始，培養液pH下降變化平穩。

TS-總糖；RS-還原糖；CA-檸檬酸；GM-糖化酶圖1 發酵罐培養的黑曲霉種子生理特性Fig.1 Physiological properties of the seed of Aspergillus niger cultured in the fermenter

檸檬酸發酵過程屬于淀粉質原料粗料發酵，淀粉質原料經液化后利用黑曲霉自身分泌的糖化能力進行同步糖化發酵?；谕教腔l酵的工藝特點，發酵過程中葡萄糖生成速度會顯著影響發酵效率的提升，黑曲霉糖化酶活力會直接影響葡萄糖供給速率[27-28]；因此，轉接發酵時，種子糖化酶活力會顯著影響發酵過程。種子糖化酶活力及生長動力學變化規律如圖2所示，總糖消耗速率與檸檬酸合成速率均呈現先升高后下降的趨勢，糖化酶活力呈現類似的趨勢；糖化酶活力可以直觀反映種子活力，因此，可以選擇糖化酶活力作為移種的特征指標。

圖2 發酵罐培養的黑曲霉種子生長動力學Fig.2 Growth kinetics of the seed of Aspergillus niger cultured in the fermenter

2.3 基于黑曲霉種子糖化酶活力移種的檸檬酸發酵

通過對發酵罐培養的黑曲霉種子生理特性與生長動力學參數考察，黑曲霉自身分泌的糖化酶活力能夠直觀反映種子活力，契合檸檬酸同步糖化發酵的特征，為考察以糖化酶活力為移種標準的發酵過程，將發酵培養過程中不同糖化酶活力的種子轉接搖瓶發酵培養，發酵結果如圖3所示。隨著接入種子糖化酶活力的增加，檸檬酸產量明顯增加，發酵殘總糖明顯降低；在酶活力最高時轉接發酵(酶活力270 U/mL)，檸檬酸產量最高，發酵殘糖最低。以上研究結果表明，種子較高的糖化酶活力，能夠較好地協同檸檬酸同步糖化發酵過程，因而可以選擇糖化酶活力作為移種的特征指標。

A-種齡20 h，酶活210 U/mL; B-種齡22 h，酶活240 U/mL; C-種齡24 h，酶活270 U/mL; D-種齡26 h，酶活229 U/mL; E-種齡28 h，酶活196 U/mL圖3 不同糖化酶活力移種的檸檬酸發酵Fig.3 Citric acid fermentation based on the glucoamylase activity of the seed of Aspergillus niger

2.4 基于孢子超聲波預處理與糖化酶活力移種的檸檬酸發酵

在微生物發酵過程中，發酵菌種質量是決定發酵成敗的關鍵，選擇合適的移種時機有助于提高發酵效率。超聲波預處理孢子，可以激活了孢子受體，啟動孢子系列反應，縮短孢子萌發時間，提高種子活力。黑曲霉種子生長過程中，自身能夠分泌糖化酶，選擇高活力的糖化酶種子轉接發酵，能夠協同檸檬酸同步糖化發酵，提高發酵效率。超聲波預處理孢子120 s培養種子，與糖化酶活力最高時移種方式為實驗組，以孢子直接接種培養種子，與傳統種齡移種方式為對照組，結果如圖4與表2所示。圖4可以看出，實驗組比對照組需要更短調整期，檸檬酸產量呈直線上升的趨勢(圖4-a)，實驗組的檸檬酸合成速率明顯高于對照組(圖4-d)；發酵殘總糖濃度直線下降的趨勢，實驗組消耗速率高于對照組(圖4-b)；發酵還原糖濃度呈現先增加后下降的趨勢，實驗組下降趨勢明顯快于對照組(圖4-c)。研究結果表明，孢子經過超聲波預處理后，縮短種子培養周期，培養的種子活力更高；糖化酶活力最高時轉接發酵，縮短產酸調整期，保障葡萄糖供給速率，協同檸檬酸發酵過程，提高發酵效率。發酵過程參數如表2所示，發酵周期縮短6 h，檸檬酸體積產率由2.55±0.09 g/L提高到2.85±0.17 g/L，提高11.76%，總發酵周期(移種時機與發酵周期)縮短7.9 h。以上研究結果表明，組合孢子預處理培養種子與糖化酶活力表征的移種策略，能夠協同檸檬酸同步糖化發酵過程，顯著提高了發酵效率。

圖4 兩種模式下的檸檬酸發酵中檸檬酸產量(a)，殘總糖(b)，殘還原糖(c)與檸檬酸合成速率(d)Fig.4 Citric acid (a), residual total sugar (b), residual reducing sugar (c), and citric acid production (d) in the two fermentation modes

培養模式種子移種時機/h發酵周期/h檸檬酸產量/(g·L-1)殘總糖/(g·L-1)體積產率/[g·(L·h)-1]總發酵時間/h對照組254±0264±18163±1818±12255±009894±01實驗組235±0858±23165±3617±13285±017815±01

注：對照組為孢子直接接種培養與傳統種齡移種方式；實驗組為孢子超聲波預處理120 s培養與糖化酶活力移種方式。

3 結論

微生物發酵過程中，高質量種子是決定發酵成敗的關鍵因素?；诤谇规咦用劝l的生理特性，提出超聲波預處理孢子120 s，誘導孢子快速萌發，縮短種子培養時間，提高種子活力，發酵產率提高8.13%。在發酵罐水平培養種子，系統研究其整個生命過程中生理學特性及生長動力學參數，發現自身分泌糖化酶并能直觀反映細胞活力，契合檸檬酸同步糖化發酵的特點，可以作為移種的特征指標。基于超聲波誘導孢子萌發與糖化酶活力表征的移種策略，移種后的菌種活力顯著提升，產酸調整期縮短，發酵產率提升11.76%，總發酵時間縮短7.9 h，顯著提高了發酵效率。

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High efficient production of citric acid integrated strategies of the ultrasonic pretreated the spores and glucoamylase representing seed-transferring

WANG Bao-shi1, CHEN Jian1,2, SUN Fu-xin3, PANG Hai-qiang4, LI You-ran1,ZHANG Liang1, DING Zhong-yang1, GU Zheng-hua1, SHI Gui-yang1*

1 (National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2 (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3 (Jiangsu Guoxin Union Energy Co., Ltd., Yixing 214203, China) 4 (Shandong Feixian Inspection and Detection Center, Feixian 273400, China)

As the most mature platform-compound, the demand for citric acid is increasing due to the application in emerging industry and important practical significance of high-efficient production possess. Given the defects of long-term lag phase in the early stage of the seed culture and instable strain activity, the spores were treated with ultrasonic wave for 120 s to induce the cascade reaction and activate the spores, thus the seed culture time shortened by 1.5 h and the fermentation efficiency was improved by 8.13%. Based on the regular changes of the key parameters in the whole life cycle of theAspergillusnigercultured in the fermenter, their own glucoamylase could directly reflect the cell viability and be presented as the seed-transferring index for simultaneous saccharification and fermentation. Pretreatment of spores with ultrasonic was combined with seed-transferring based on glucoamylase activity to obtain high activity seed and high-efficient synthesis of citric acid, thus total fermentation time shortened by 7.9 h and fermentation efficiency was improved by 11.76%. These results were also meaningful for the fermentation processes with the filamentous fungi or similar microbiology as main fermentative strain.

ultrasonic induction;Aspergillusnigerspores; simultaneous saccharification and fermentation; citric acid; glucoamylase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612001

博士研究生(石貴陽教授為通訊作者，E-mail: gyshi@jiangnan.edu.cn)。

國家高技術研究發展計劃(863計劃，No: 2015AA020302)；江蘇省產學研前瞻性聯合研究項目 (No. BY2015019-13)

2016-04-13，改回日期：2016-05-06