雷帕霉素對(duì)肝臟缺血-再灌注中線粒體DNA D-Loop區(qū)的修復(fù)作用

余曦 張瑩 顏桂蘭 唐祥蜀

(1.貴州省人民醫(yī)院急診外科；2.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

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雷帕霉素對(duì)肝臟缺血-再灌注中線粒體DNA D-Loop區(qū)的修復(fù)作用

余曦1張瑩2△顏桂蘭2唐祥蜀2

(1.貴州省人民醫(yī)院急診外科；2.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

目的 研究大鼠肝臟缺血-再灌注(HIRI)損傷中mtDNA的損傷機(jī)制及雷帕霉素對(duì)其的修復(fù)作用。方法 SD大鼠60只，制作大鼠肝臟缺血-再灌注模型，分為A、B、C、D四組；A組：肝臟缺血30 min處理；B組：缺血50 min處理；C組：缺血50 min并雷帕霉素干預(yù)處理；D組：假手術(shù)組。分別于術(shù)后24 h、3 d、5 d處死，取部分肝組織進(jìn)行線粒體DNA D-Loop區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，與GENBANK參考序列對(duì)比查找變異位點(diǎn)。結(jié)果 在HIRI中存在DNA D-Loop區(qū)突變，其中C組大鼠mtDNA D-Loop區(qū)突變率低于B組(P<0.05)。結(jié)論 HIRI中mtDNA D-Loop區(qū)產(chǎn)生突變，而雷帕霉素可能通過(guò)降低線粒體DNA D-Loop區(qū)突變率而減輕其氧化損傷，從而對(duì)肝臟缺血-再灌注損傷過(guò)程產(chǎn)生保護(hù)作用。

肝臟； 缺血-再灌注； 線粒體DNA D-Loop； 雷帕霉素； 大鼠

肝臟缺血-再灌注損傷(HIRI)是臨床上肝臟外科常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，如何減輕HIRI對(duì)肝細(xì)胞的損傷，保護(hù)肝功能，防止肝衰竭一直是國(guó)內(nèi)外研究者十分關(guān)注的課題[1]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)除細(xì)胞核以外唯一含有DNA的細(xì)胞器，隨著對(duì)線粒體DNA(mtDNA)的深入研究，發(fā)現(xiàn)多種疾病與mtDNA突變相關(guān)，但對(duì)于HIRI中mtDNA突變的研究較少，我們通過(guò)建立大鼠HIRI模型，對(duì)mtDNA D-Loop區(qū)進(jìn)行測(cè)序，分析其變異位點(diǎn)，了解HIRI時(shí)mtDNA D-Loop區(qū)的突變情況，并探討雷帕霉素對(duì)HIRI中mtDNA D-Loop突變位點(diǎn)的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF級(jí)雄性SD大鼠(n=60)，體質(zhì)量200～250 g，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。以滅菌藥用蓖麻油配制濃度為0.345 mg/mL的雷帕霉素溶液用于灌胃。基因組DNA提取試劑盒由北京天更生物提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與造模 60只動(dòng)物隨機(jī)分為四組，乙醚氣體麻醉，無(wú)菌條件下參照Pringle’s[2]法制作大鼠肝臟HIRI模型,切開(kāi)腹壁后找到第一肝門(mén)，以血管夾夾閉，以肝臟表面出現(xiàn)瘀斑為缺血成功表現(xiàn)。A組(18只)：肝臟缺血30 min恢復(fù)血供；B組(18只)：肝臟缺血50 min恢復(fù)血供；C組(18只)：肝臟缺血50 min恢復(fù)血供；D組(6只)：假手術(shù)對(duì)照組：僅翻動(dòng)肝臟隨即關(guān)腹。其中C組在術(shù)前3 d和術(shù)后用雷帕霉素[1.5 mg/(kg·d)]灌胃，而A組和B組在術(shù)前3 d和術(shù)后每日僅用滅菌藥用蓖麻油1 mL灌胃1次。各組大鼠于術(shù)后24 h、3 d、5 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死1/3,取部分肝組織于液氮保存。

1.2.2 肝臟組織基因組DNA的提取 取肝臟組織15 mg按試劑盒說(shuō)明提取肝臟組織基因組DNA，分光光度計(jì)測(cè)定260 nm和280 nm處吸光度(A)值，A260/A280值在1.8～2.0者用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3 肝臟組織基因組DNA PCR擴(kuò)增 通過(guò)Primer3 Output軟件設(shè)計(jì)引物：F:5-ACA TTA AAT TAT TTT CCC CAA GCA-3’；R:5-TTG GTG TAT GTG GAA TTT TCT GA-3’擴(kuò)增長(zhǎng)度850 bp。由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。取2 μL基因組DNA溶液進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體：ddH2O 10 μL Mix(含Mg2+)13 μL上、下游引物(0.5 μg/μL)各1 μL，DNA模板1 μL，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，制備2%瓊脂糖凝膠，用移液器取5 μL上述PCR產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣，DL2000 Marker用量5 μL，120 V，40 min后置凝膠成像儀下成像。

1.2.4 測(cè)序 上述剩余PCR產(chǎn)物4 ℃保存，取PCR產(chǎn)物送上海生工生物有限公司純化、測(cè)序。將結(jié)果與NCBI GENBANK參考序列(X04734.1)對(duì)比查找變異位點(diǎn)。測(cè)序結(jié)果所得突變率利用SPSS19.0軟件分析，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)方法分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 mtDNA D-Loop區(qū)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果 各PCR產(chǎn)物于瓊脂凝膠中電泳、成像，可見(jiàn)條帶清晰明亮、完全、整齊,純度較高,無(wú)降解及雜質(zhì)、及拖帶現(xiàn)象產(chǎn)生，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物大小為850 bp左右(圖1)。

注：M.marker；1～4.為術(shù)后5 d A、B、C、D四組條帶；5～8.為術(shù)后3 d A、B、C、D四組條帶；9～12.為術(shù)后1d A、B、C、D四組條帶。圖1 各組大鼠肝臟mtDNA D-loop區(qū)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增凝膠成像圖

2.2 各組大鼠肝臟組織mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸變異情況 各組mtDNA D-Loop區(qū)測(cè)序結(jié)果與GENBANK參考序列通過(guò)MegAlign軟件進(jìn)行對(duì)比后共發(fā)現(xiàn)2個(gè)點(diǎn)缺失、51個(gè)點(diǎn)突變、8個(gè)插入及1個(gè)片段缺失共62個(gè)變異位點(diǎn)，而D組也發(fā)現(xiàn)有7個(gè)位點(diǎn)與參考序列有差異，此現(xiàn)象我們考慮為mtDNA D-Loop的多態(tài)性，剩余發(fā)現(xiàn)的核苷酸變異我們考慮為HIRI所致，見(jiàn)表1。B組突變率較A、C組明顯升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠mtDNA D-Loop區(qū)測(cè)序結(jié)果

注：*此處合計(jì)為減去D組7個(gè)考慮為多態(tài)性后剩余變異數(shù)目。

3 討 論

線粒體是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵場(chǎng)所[3]，缺血、缺氧等因素均可引起線粒體結(jié)構(gòu)、功能的異常，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙并引起其他細(xì)胞器乃至整個(gè)細(xì)胞、組織的變化。細(xì)胞中活性氧(ROS)的大量產(chǎn)生可導(dǎo)致DNA片段化從而造成DNA損傷[4]，而mt DNA相對(duì)核DNA其缺乏組蛋白的保護(hù)以及有效的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng),并且mtDNA長(zhǎng)期暴露于ROS中,使得mt DNA比核DNA更容易損傷，其損傷將直接引起線粒體ATP生成減少，從而加劇細(xì)胞損傷[5]。研究[6]表明，肝細(xì)胞mtDNA的損傷在HIRI中起重要作用，大鼠mtDNA D-Loop長(zhǎng)度為901 bp，mtDNA復(fù)制的起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子便位于其中，可調(diào)控mtDNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄[7]，mtDNA D-Loop區(qū)的突變可能會(huì)影響mtDNA的復(fù)制，該區(qū)也是mtDNA突變的熱點(diǎn)部分[8]，所以我們選擇D-Loop區(qū)作為研究對(duì)象。

雷帕霉素目前作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床，但在缺血-再灌注損傷中是否存在保護(hù)機(jī)制尚有爭(zhēng)論。雷帕霉素可保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)、功能，研究[9]表明雷帕霉素可提高缺氧狀態(tài)中線粒體內(nèi)呼吸酶的活性并減少氧自由基的產(chǎn)生從而增強(qiáng)線粒體的呼吸作用，T.Pan[10]等的研究表明雷帕霉素可減輕乳胞素引起的細(xì)胞變性凋亡，減輕線粒體損傷。Y.Dai[11]等的研究表明雷帕霉素可用于治療mtDNA突變的相關(guān)疾病。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，在HIRI中，在mt DNA D-loop區(qū)內(nèi)共發(fā)現(xiàn)62個(gè)變異位點(diǎn)，其中B組每例大鼠測(cè)序結(jié)果都出現(xiàn)變異，顯示該區(qū)域的多態(tài)性且具有高度突變性，同時(shí)也說(shuō)明mtDNA的損傷對(duì)缺血、缺氧極為敏感，并且肝臟缺血時(shí)間越長(zhǎng)，基因突變率越高，而在D組(即對(duì)照組)并未發(fā)現(xiàn)以上突變，說(shuō)明我們所發(fā)現(xiàn)的mtDNA突變?yōu)橹虏⊥蛔儭，F(xiàn)有研究[12]已證實(shí)，ROS可以影響DNA的穩(wěn)定性，并導(dǎo)致高活性的DNA堿基如鳥(niǎo)嘌呤的損傷，是許多疾病產(chǎn)生的原因之一。在HIRI中，造成肝功能損害的一個(gè)重要原因即是ROS，線粒體即為ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵場(chǎng)所。所以通過(guò)本研究，我們考慮，缺血缺氧首先引起線粒體功能障礙，繼而產(chǎn)生能量代謝障礙，使細(xì)胞內(nèi)生成大量ROS，而高水平的ROS可造成DNA鏈斷裂、堿基與核糖氧化、堿基缺失，線粒體DNA D-loop的基因突變可對(duì)mtDNA的拷貝產(chǎn)生影響，可能導(dǎo)致編碼區(qū)突變，從而引起相應(yīng)蛋白質(zhì)合成改變；還有研究[13]認(rèn)為，正常細(xì)胞的mtDNA轉(zhuǎn)錄水平降低提高了細(xì)胞的凋亡水平，發(fā)生程序性死亡。而mtDNA D-Loop區(qū)的突變勢(shì)必影響mtDNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制水平，進(jìn)而進(jìn)一步加劇對(duì)肝細(xì)胞、組織的損傷。我們的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用雷帕霉素干預(yù)，mt DNA D-Loop區(qū)基因突變率明顯下降，其可能機(jī)制為，雷帕霉素可通過(guò)維持線粒體的結(jié)構(gòu)及功能，減少缺血-再灌注中缺氧所帶來(lái)的ROS等呼吸鏈功能的障礙所造成的細(xì)胞凋亡，并通過(guò)降低缺血缺氧時(shí)DNA的突變率，維持線粒體的功能，從而減輕缺血-再灌注中肝臟細(xì)胞的損傷程度。

而mtDNA D-Loop區(qū)基因突變后會(huì)對(duì)相應(yīng)的tRNA造成什么樣的影響，以及影響了哪些編碼區(qū)DNA的拷貝，并造成相應(yīng)的蛋白表達(dá)異常，值得我們進(jìn)一步深入研究。

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Recovery effect of rapamycin to mitochondrial DNA D-Loop in liver iachemia

YuXi1,ZhangYing2,YanGuilan2,TangXiangshu2.

1.DepartmentofEmergencySurgery,Guiyang550002,China. 2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,GuizhouProvincialPeoole'sHospital,Guiyang550002,China.

Objective To evaluate the hepatic ischemia-reperfusion injury in rats of mitochondrial DNA damage and rapamycin to its repair effect. Methods To be established the whole liver ischemia-reperfusion injury in rats model, and divided into four groups which were group A (ischemia 30 min group), Group B (ischemia 50 min group), Group C (preoperative rapamycin lavage, 50 min of ischemia group), and Group D (control group). 24 h after surgery, 3, 5 days respectively execution groups of animals, take part in liver mitochondrial DNA D kit instructions-Loop area for amplification and product sequencing, compared with GENBANK reference sequence search mutation loci. Results Group C mitochondrial DNA D-Loop area mutation rate was lower than that in group B (P< 0.05). Conclusion Liver ischemia-reperfusion injury of mutations in mitochondrial DNA D-Loop area, rapamycin could alleviate the liver ischemia0reperfusion injury, its mechanism may be through reduced mitochondrial DNA D-Loop area mutation rate so as to reduce the oxidative damage, which produces the process of liver ischemia-reperfusion injury protection.

Liver; Ischemia-reperfusion injury; Mitochondrial DNA D-Loop; Rapamycin; Rats

貴州省科技廳專(zhuān)項(xiàng)基金[黔科合J(2008)-2302]；貴州省優(yōu)秀青年科技人才基金[黔科合人字(2011)29]

R-332，R575

A

1000-744X(2016)03-0230-03

2015-10-03)

△通信作者，E-mail：zhangyingdoc@163.com