β-catenin在口腔鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

馬竹君 馮紅超 宋宇峰 高瓊 孫昊軒

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴陽市口腔醫院，貴州 貴陽 550002；3.貴州省食品藥品監督管理局，貴州 貴陽 550000；4.貴州醫科大附屬口腔醫院頜面外科；5.河北省眼科醫院口腔頜面外科，河北 邢臺 054001)

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β-catenin在口腔鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

馬竹君1馮紅超2△宋宇峰3高瓊4孫昊軒5

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴陽市口腔醫院，貴州 貴陽 550002；3.貴州省食品藥品監督管理局，貴州 貴陽 550000；4.貴州醫科大附屬口腔醫院頜面外科；5.河北省眼科醫院口腔頜面外科，河北 邢臺 054001)

目的 檢測口腔鱗癌中上皮間質化(EMT)相關蛋白和β-連環素(β-catenin)的表達初步探討其意義。方法 用免疫組法檢測32例口腔鱗癌組織及正常組織中上皮標記物：上皮-鈣黏蛋白(E-cad)及細胞角蛋白(CK)、β-catenin的表達。結果 口腔鱗癌組β-catenin表達明顯高于正常組織組(P<0.05)，CK及E-cadherin表達明顯低于正常組織組(P<0.05)；β-catenin在T4+T3組的表達顯著高于T1+T2組(P<0.05)，E-cadherin的表達明顯低于T1+T2組(P<0.05)；有淋巴結轉移組β-catenin表達高于無淋巴結轉移組(P<0.05)，E-cadherin、CK表達低于無淋巴結轉移組(P<0.05)。結論 口腔鱗癌組織中存在EMT現象，E-cadherin、CK及β-catenin在OSCC與正常組織表達中有差異，β-catenin可能參與OSCC組織發生EMT的進程，促進口腔鱗癌浸潤及轉移。

口腔鱗癌； β-連環素； 細胞角蛋白； 上皮-鈣黏蛋白； 上皮間質化； 淋巴結轉移

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是口腔最常見的惡性腫瘤，其頸部淋巴結轉移是目前臨床上腫瘤致死的主要因素[1]，嚴重威脅人類的生命健康。上皮細胞-間充質轉化(EMT)，指上皮細胞通過特定程序轉化為具有較高侵襲能力的間質表型過程[2]。近年來，國內外對于EMT的研究開始向腫瘤領域延伸。本實驗通過免疫組化PV二步法檢測正常口腔組織和OSCC組織中β-catenin和EMT標記物的表達，初步探索β-catenin與EMT現象的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集貴醫附院口腔頜面外科2009年7月至2015年7月手術切除的，術前未采用任何針對腫瘤的治療(如放療、化療等),經組織蠟塊保存完好的口腔鱗癌標本。均經常規病理檢查確診為鱗狀細胞癌患者32例(男23例，女9例)，年齡42～78歲，平均60歲；高分化21例，中低分化11例；無淋巴結轉移13例，有淋巴結轉移19例，無發生遠處轉移者。另設12例口腔黏膜正常組織作對照。

1.2 試劑 小鼠抗人細胞角蛋白(廣譜)單克隆抗體、小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體及DAB顯色試劑盒、免疫組化PV試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，小鼠抗人β-catenin單克隆抗體購自恩晶生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 免疫組織化學染色行PV二步法，組織蠟塊經厚5 μm連續切片，脫蠟水化后，檸檬酸抗原修復液高壓熱處理修復抗原，3%去離子水封閉內源性過氧化物酶分別加入：β-catenin(1∶50)、E-cadherin(1∶100)、細胞角蛋白(1∶100)一抗工作液、4 ℃孵育過夜。加入生物素化二抗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。PBS代替一抗，做陰性對照。實驗程序嚴格按照試劑說明書進行。另取一張切片行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.4 結果判定 免疫組織化學及原位雜交每例切片隨機選擇10個視野(放大200倍)拍照。參考相關文獻，以Imagepro-plus圖像分析系統進行平均光密度(MOD)分析，分析中進行了光密度校準及空間標定，按照陽性表達在照片中的范圍在照片中畫出測量區域，即總面積(Area Sum)，讀取積分光密度(IOD)數值，作為這張照片的累積光密度值。MOD計算方法為MOD=IOD/Area(Sum)。

1.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件統計，β-catenin、E-cad、CK光密度不滿足正態分布，參數檢驗(P>0.05)，故采用中位數及四分位間距M(P25，P75)表示。正常組織與口腔鱗癌組織光密度的差異及不同臨床特征下β-catenin、E-cad、CK光密度比較，采用Mann-Whitney非參數檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 β-catenin、E-cadherin、CK在OSCC及正常組織中的表達 β-catenin在正?？谇击[狀上皮組織細胞質中少量或幾乎無表達(圖1A)，在OSCC組織細

胞質中表達增多，呈棕黃色或棕褐色顆粒，在有的OSCC組織中存在細胞核的表達(圖1B)。E-cad陽性信號主要定位于正常組織上皮細胞(圖1C)，在OSCC組織中多表達于有細胞極性的鱗狀上皮部分，少數呈淡黃色的不均質點狀分布，多數癌巢組織無著色表現(圖1D)；CK主要定位于細胞質，與正常組織表達相比(圖1E)，在癌巢部位的表達較低(圖1F)。

圖1 免疫組織化學染色結果 (SP×20)

2.2 β-catenin、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達的MOD值 β-catenin、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達的MOD值見表1，在OSCC組織中，E-cad及CK的表達明顯低于正常組織(P<0.05)。

表1 β-catenin、E-cad、CK在OSCC與正常組織表達的MOD值

2.3 OSCC組織中β-catenin、E-cad、CK表達與臨床病理資料的關系 OSCC組織中β-catenin、E-cad、CK表達與臨床病理資料的關系見表2。β-catenin、E-cad在有淋巴轉移組中高于無淋巴結轉移組(P1=0.013，P2<0.01)，在T1+T2分期中表達低于T3+T4分期(P1=0.013,P2=0.004)；CK在有淋巴轉移組中高于無淋巴結轉移組(P=0.048)，以上差異均有統計學意義(P<0.05)；β-catenin、E-cad、表達在不同分化組中無明顯差異；CK的表達在不同腫瘤分期中無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 OSCC組織中β-catenin、E-cad、CK表達與臨床病理資料的關系

3 討 論

Wnt/β-catenin信號通路，是一類進化非常保守的信號通路，它通過激活有關靶基因以控制細胞生長、分化、凋亡等方式，參與機體胚胎發育增殖、分化等過程[3]。在成熟細胞中處于關閉狀態。近年來研究[4]顯示，當Wnt/β-cat信號通路被異常激活時，其可參與腫瘤的形成，同時其與腫瘤EMT的發生，尤其是上皮源性腫瘤的EMT發生密切相關。

E-cad，是一種重要黏附分子，最經典的上皮細胞標志物。在細胞膜上，E-cad與β-catenin形成復合體，維持細胞連接并參與信號傳導。目前研究[5]發現，在結直腸癌等腫瘤中發現E-cad的表達下調，認為E-cad的減少或丟失是上皮來源的腫瘤細胞侵襲的前提條件，是發生EMT的重要標志。CK 是上皮細胞特征性標記物，具有多個亞型，根據上皮細胞類型及分化階段的不同，可有不同亞型的CK表達[6]。本研究結果顯示，E-cad、CK在OSCC組織中表達低于正常組織，這與多數研究結果相似，提示OSCC中上皮標記物減少；本研究結果顯示，E-cad、CK在無淋巴結轉移組表達較有轉移組高，提示OSCC發生淋巴結轉移與E-cad和CK的異常表達密切相關，OSCC瘤細胞可能失去上皮細胞表型而向間質細胞轉化，發生EMT現象。

β-catenin是一種可溶性蛋白，具有雙重作用。一方面與E-鈣粘素形成復合體，維持上皮極性和完整性；另一方面，作為Wnt通路的關鍵蛋白在機體發育時期調節細胞的增殖。 β-catenin在細胞質內表達增高及細胞核表達是Wnt/β-cat信號通路激活的重要標志，在成熟機體中，β-catenin在細胞質中表達較少甚至幾乎無表達，β-catenin異常表達增高是此信號通路參與腫瘤進程的關鍵[7]，已有研究[8-9]發現，在結腸癌，原發性肝細胞癌中，β-catenin出現高表達，在已完成EMT轉化的結腸癌中，細胞質中的β-catenin積累水平較高。本研究結果顯示，β-catenin在OSCC中表達較正常組織高(P<0.05)，在T1+T2 期表達較T3+T4低(P<0.05)，這一研究結果與大多數臨床研究結果相似，提示在OSCC中β-catenin發生了異常高表達，隨著腫瘤累及越大，β-catenin的表達越高；本研究顯示，β-catenin在發生淋巴結轉移組表達較未發生淋巴結轉移組高，提示β-catenin的異常高表達與淋巴結轉移密切相關。本實驗證實，E-cad、CK、β-catenin在OSCC中異常表達，OSCC可能存在EMT現象，β-catenin在OSCC細胞出現異常高表達。我們認為，Wnt/β-cat信號通路可能被異常激活，使瘤細胞得以增殖、分化失控，分化失控有可能使瘤細胞由上皮細胞向間質細胞轉化，獲得遷移能力，促進EMT發生[10]，使OSCC發生淋巴結轉移。

本實驗通過研究E-cad、CK、β-catenin在OSCC中的表達，證實在人OSCC中存在EMT現象。通過分析各因子與臨床病理資料之間關系，我們認為Wnt/β-cat通路可能參與OSCC中EMT的發生，β-catenin是其中的重要因子，與EMT的發生有關。β-catenin不僅是Wnt/β-cat信號通路的關鍵蛋白，也與E-cad一起維持細胞間連接的穩定，干擾β-catenin在瘤組織中的表達水平，并維持其與E-cad復合體的穩定，從而維持細胞間緊密連接，降低細胞移動的趨勢，有可能成為控制腫瘤發生EMT，降低腫瘤侵襲轉移率的新的研究方向。

[1] 馮紅超，宋宇峰，魏宏琳，等.巨噬細胞移動抑制因子和基質金屬蛋白酶2在口腔癌生長和轉移中的作用[J].現代口腔醫學雜志，2009，23(2):135-137.

[2] 鄒丹丹，湯顯斌.上皮細胞間質轉化與腫瘤干細胞[J].中華病理雜志，2013,42(1)：62-65.

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[5] Elena Scarpa, Andra s Szabo.Cadherin Switch during EMT in Neural Crest Cells Leads to Contact Inhibition of Locomotion via Repolarization of Forces[J].Developmental Cell 34, 2015,34(4):421-434.

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[9] 程云娟，羅新華，程明亮.人原發性肝癌組織中AEG-1、β-catenin和C-myc的表達及其意義[J].貴州醫藥2015，39(11)：967-969.

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Expression and significance of β-cateinin in OSCC

MaZujun,FengHongchao,SongYufeng,GaoQiong,SunHaoxuan.

1.GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 2.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,China. 3.FoodandDrugAdministrationBureauinGuizhouProvince,Guiyang550004,China. 4.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 5.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,HospitalinHebeiProvince,Xintai054001,China.

Objective To investigate the expression and clinical significance of β-catenin and EMT correlated protein. Methods 32 cases of OSCC and 10 cases of nomal human were detected by IHC to explore the expression of β-catenin and epithelial drived markers which were E-codherin and Cytokeratin. Results The expression of β-catenin in is significantly higher than that in the normal group (P<0.05); and the expression of Cytokeratin and E-cadherin is significantly lower than those in the normal group (P<0.05); the expression of β-catenin in T3+T4 group is higher than T1+T2 group (P<0.05)，The expression of E-cadherinis significantly lower than T1+T2 Group (P<0.05). The expression of β-catenin is higher than the group without lymph node metastasis (P< 0.05). The expression of E-cadherin, Cytokeratin and is lower than the group without lymph node metastasis (P< 0.05). Conclusion EMT takes place in OSCC. E-codherin, Cytokeratin and β-catenin are differently expressed in OSCC and normal epithelial tissue. β-catenin may involve the progression of EMT in OSCC, promote infiltraton and metastasis of OSCC.

OSCC； β-catenin； E-cadherin； Cytokeratin； EMT； LNM

貴陽市衛生局科學技術計劃項目 (2014筑衛科技合同字第15號); 貴州省科技計劃課題任務(黔科合LG字[2011]001號)

R730.2

A

1000-744X(2016)03-0236-03

2015-12-06)

△通信作者，E-mail：hongchaof@126.com