WWOX蛋白與突變型P53蛋白在非小細胞肺癌中的表達及意義

王軍

(滁州市第一人民醫院，安徽 滁州 239000)

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WWOX蛋白與突變型P53蛋白在非小細胞肺癌中的表達及意義

王軍

(滁州市第一人民醫院，安徽 滁州 239000)

目的 探討WWOX與突變型P53蛋白在非小細胞肺癌(NSCLC)及癌旁組織中的表達與腫瘤臨床病理參數的關系及兩者表達的相關性。方法 用免疫組化elivision法分別檢測WWOX及突變型P53蛋白在51例NSCLC及20例癌旁正常組織中表達情況。結果 WWOX蛋白在NSCLC組織中與癌旁正常組織中表達的陽性率分別為25.49%(13/51)和85.0%(17/20)。突變型P53蛋白在NSCLC組織中與癌旁正常組織中表達的陽性率分別為58.82%(30/51)和10.0%(2/20)。WWOX蛋白的陽性率與NSCLC的組織分化程度、病理類型、吸煙、有無淋巴結轉移的表達差異有統計學意義(P<0.05)，而與患者的年齡、性別及腫瘤TNM分期無關(P>0.05)。突變型P53的陽性率與NSCLC的分化程度、腫瘤TNM分期、有無淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與患者的年齡、性別、吸煙、病理類型無關(P>0.05)。WWOX蛋白、突變型P53在NSCLC中的陽性表達呈負相關(r=-3.33，P<0.05)。 結論 WWOX蛋白和突變型P53在NSCLC及癌旁組織的表達有顯著差異。WWOX與突變型P53蛋白與NSCLC的發生、發展密切相關，并可能起協同作用，其綜合檢測對肺癌的病情判斷和預后評價具有一定價值。

非小細胞肺癌； WWOX； P53； 免疫組化

細胞的生長是推動細胞周期與抑制其進行的基因之間微妙平衡的結果。任何一種產物的表達異常，都可能導致細胞生長的失控。腫瘤抑制基因是在正常細胞中存在的一類基因，抑制細胞過度生長、增殖而抑制腫瘤的發生。包含氧化還原酶的WW域基因(WWOX)是2000年由A.K.Bednarek[1]等鑒定出一個候選的抑癌基因，位于在染色體普通脆性位點FRA16D(16q23-32q24.1)區域。本研究用免疫組化方法檢測WWOX 蛋白、突變型P53在NSCLC組織中的表達，并分析其與臨床病理參數的關系及兩者的相關性，旨在初步明確二者在NSCLC發生、發展、轉移中的作用，尤其是明確其與NSCLC淋巴結轉移的關系，為患者的預后判斷提供有價值的分子生物學指標。

1 材料與方法

1.1 標本及臨床資料 選取蚌埠醫學院第一附屬醫院2009年4月至2011年7月肺癌手術切除標本51例，經病理證實為NSCLC，并取癌旁正常組織20例，年齡41～76歲，中位年齡68.2歲。排除術前有放射治療或化學治療史的患者。51例肺癌患者中，男性患者32例，女性患者19例；鱗癌34例，腺癌17例；高分化14例，中分化16例，低分化21例；臨床分期：依據1997年國際抗癌聯盟(UICC)TNM分期標準，Ⅰ+Ⅱ期36例，Ⅲ+Ⅳ期15例。有淋巴結轉移的28例，無轉移的23例。

1.2 主要試劑 兔抗人WWOX多克隆抗體(1∶100) ，購自奧博森生物醫藥有限公司，鼠抗人P53多克隆抗體和第二代即用型免組化ElivisionTM plus免疫組化試劑盒，均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 方法 常規石蠟包埋，4 μm連續切片。采用免疫組織化學Elivision法，按試劑盒使用說明書進行。切片常規脫蠟入水，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，高壓鍋抗原修復，加入一抗4 ℃過夜，DAB顯色，蘇木素復染，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 試驗結果的觀察和判斷 本研究中實驗組和對照組均由我院病理科資深醫師在相同條件下觀察每張切片后對結果作出判斷。兔抗鼠WWOX多克隆抗體，陽性著色定位于腫瘤細胞質，呈棕黃色顆粒。WWOX蛋白表達的判定[2]：(1)按陽性細胞數的比例評分:0分，0～<5%;1分，5%～<25%;2分,25%～<50%;3分,50%～<75%；4分: ≥75%。(2)以著色的程度評分，1分弱陽性，2分中等陽性，3分強陽性。以上兩者之和>1判斷為陽性標本。陰性對照以 PBS代替一抗。突變型P53蛋白陽性著色定位于細胞核，呈棕黃色顆粒狀或團塊狀。突變型P53蛋白表達的判定：參照Takahashi 雙評分半定量法進行評分[3]，于免疫著色最多區域計數1 000個肺癌細胞。按陽性細胞數所占百分比計分:0分：<10%；1分>10%～<25%；2分25%～<50%；3分50%～<75%；4分≥75%以上。以著色的程度計分:0分:無著色；1分黃色；2分棕黃色；3分棕褐色。著色強度與陽性細胞百分數之和≥3分即為免疫反應陽性。

1.5 統計學方法 所有資料經SPSS l7.0統計軟件包進行數據處理。計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。相關性分析采用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 WWOX蛋白和突變型P53蛋白在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達情況 本實驗中，WWOX蛋白在NSCLC組織及癌旁正常組織中陽性表達率分別為25.49%(13/51)和85%(17/20)，在癌組織中的表達低于癌旁組織(χ2=20.851，P<0.01)。突變型P53蛋白在NSCLC組織及癌旁正常組織中陽性表達率為58.8%(30/51)和10.0%(2/20)，突變型P53蛋白在癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，二者差異有統計學意義(χ2=13.833，P<0.01)。

2.2 WWOX蛋白和突變型P53蛋白的表達與NSCLC各臨床病理因素的關系 WWOX蛋白在NSCLC組織中，吸煙組明顯低于不吸煙組，鱗癌組明顯低于腺癌組，有淋巴結轉移組明顯低于無淋巴結轉移組，有顯著差異(P<0.05)。WWOX蛋白在高分化、中分化和低分化NSCLC組織中，陽性表達率分別為50.0%、25.0%和 9.5%，三組間比較有統計學意義，其中高分化與低分化組間差異有統計學意義(P<0.01)，而與病人的性別、年齡、及TNM分期無相關性(P>0.05)。突變型P53蛋白在高分化、中分化和低分化NSCLC組織中，陽性表達率分別為 28.57%、68.75%和71.43%，三組間比較差異有統計學意義，其中高分化與中低分化組間有極顯著性差異(P<0.01)，只有中分化與低分化組間無統計學意義；突變型P53蛋白在TNM分期Ⅰ+Ⅱ與Ⅲ+Ⅳ組間差異有統計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移的NSCLC組織中，突變型P53蛋白陽性表達率高于無淋巴結轉移者，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)，而與病人的性別、年齡、吸煙史及病理類型無相關性(P>0.05)。見表1

表1 WWOX蛋白在NSCLC中的表達與臨床病理參數的關系[n(%)]

2.3 NSCLC組織中WWOX蛋白、突變型P53兩者表達的相關性 本組51例NSCLC組織中，WWOX、突變型P53均陽性占7.84%(4/51)，WWOX陽性、突變型P53陰性占17.65%(9/51)，WWOX陰性、突變型P53陽性占50.98%(26/51)，WWOX、突變型P53均陰性占23.53%(12/51)，P<0.05，r=-3.33，兩者的表達存在負相關。

3 討 論

本實驗中在NSCLC組織中WWOX蛋白表達缺失率為74.51%(38/51)，顯著高于癌旁正常組織中的15%(3/20)，二者之間差異有統計學意義(P<0.01)。即使NSCLC組織中有WWOX蛋白表達 ，表達強度也顯著低于癌旁正常組織，提示在NSCLC的發生可能與WWOX基因的表達缺失有關。WWOX基因在許多腫瘤中表達減弱或消失，常表現為等位基因的純合性缺失、雜合性缺失和基因突變有關。其中腫瘤中WWOX 基因發生雜合性缺失更為常見。發生位點通常為 D16S3029、D16S3096、D16S504、D16S516及D16S518。在胃癌中雜合性缺失發生率45.7%[4]、食管鱗狀細胞癌中發生率41.4%[5]。這種缺失不僅與腫瘤的發生呈正相關性，還與TNM分期密切相關。甲狀腺癌中WWOX基因282位點 (rs3764340)發生突變，脯氨酸突變為丙氨酸，引起WWOX啟動子及外顯子超甲基化，顯著提高了發生甲狀腺癌的幾率[6]。E.M.Lange[7]用全基因組連鎖分析方法發現WWOX rs1079635位點的突變可能是前列腺癌的易感性因素。K.S.Higginbotham[8]等研究中發現WWOX基因的錯義突變與乳腺癌的臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移數目有顯著相關。本實驗中WWOX的表達缺失與組織分化程度，組織學類型相關(P<0.05)，與吸煙顯著相關(P<0.01)。在肺癌組織中，男性鱗癌患者WWOX蛋白表達要明顯低于女性腺癌患者，吸煙患者明顯低于不吸煙患者，這可能與煙草中的致癌因素促進WWOX甲基化所致。給予DNA甲基化轉移酶抑制劑 5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)刺激后可使 WWOX 的表達逆轉，從而抑制細胞增殖[9]。WWOX蛋白表達缺失率隨組織學分級的增高而顯著提高，提示WWOX基因表達的缺失與腫瘤的惡性程度有關。因此WWOX基因表達水平的下降可視為早期診斷NSCLC的分子標記物。C.Lan[10]等的研究顯示卵巢癌的WWOX mRNA的表達情況與孕激素、雌激素的水平，淋巴結轉移能力以及FIGO分期密切相關。在WWOX基因剔除小鼠中，出現明顯的生殖系統的形態學改變、繁殖能力顯著減退[11]；雌性小鼠下丘腦促卵泡生成素及黃體生成素激素水平顯著降低，檢測發現雄性小鼠輸精管萎縮、生殖功能下降[12]；均提示 WWOX 可能與甾體激素代謝密切相關。本實驗結果中，有淋巴結轉移的28病例中WWOX表達缺失為25例(89.29%)，而23例無淋巴結轉移的病例中WWOX表達缺失僅為13例(56.52%)，WWOX蛋白表達與NSCLC是否伴有淋巴結轉移密切相關，伴有淋巴結轉移的WWOX基因失表達率明顯高于沒有淋巴結轉移的患者，這對于評價NSCLC轉移具有指導意義。Y.L.Zhou[13]等通過基因轉染方法，將WWOX基因轉染至WWOX基因陰性表達的肺癌細胞之后發現，癌細胞的增殖能力明顯減弱、凋亡指數明顯增加、克隆集團形成能力和體內成瘤能力明顯減弱。可見，WWOX蛋白表達的高低與患者的臨床病理及預后密切相關。張繼平[14]發現，WWOX蛋白表達與腫瘤組織分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移呈正相關。

在本實驗中我們觀察到，突變型P53蛋白在NSCLC中高表達，而WWOX在NSCLC組織中表達減低或缺失。WWOX蛋白與野生型P53是壓力刺激感應下的凋亡所必須的基因，在介導凋亡途徑中發揮協調作用，在紫外線、茴香霉素UV等誘導凋亡刺激因素等作用下，JNK1瞬時激活，可抑制WWOX蛋白的表達，并且P53蛋白穩定性下降[15]。在應激凋亡過程中，WWOX蛋白還通過與JNK1、P53等細胞因子相互作用形成異源三聚體。因此，聯合檢測WWOX基因與P53基因對NSCLC的臨床早期診斷、惡性程度和預后的判定均具有重要的指導作用。

[1] Bednarek AK，Laflin KJ，Daniel RL，et al. WWOX，a novel WW domain-containing protein mapping to human chromosome16q23.3-24.1，a region frequently affected in breast cancer[J].Cancer Res，2000，60(8):2140-2145.

[2] 李秋芳，楊瑞玲，王靜, 等．WWOX蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達及其臨床意義[J].實用癌癥雜志，2008，7(23)：354-359.

[3] Takahashi Y， Kitadai Y， Bucana CD，et a1．Expression of VEGF and its receptor, KDR, correlates with vascularity metastasis and proliferation of human colo cancer[J]．Cancer Res，1995；55(18)：3964-3968．

[4] Guo W, Dong Z, Dong Y, et al. Genetic and epigenetic alterations of WWOX in the development of gastric cardia adenocarcinoma[J]. Environ Mol Mutagen, 2013,54:112-123.

[5] Guo W, Wang G, Dong Y, et al. Decreased expression of WWOX in the development of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Carcinog, 2013,52:265-274.

[6] Cancemi L, Romei C, Bertocchi S, et al. Evidences that the polymorphism Pro-282-Ala within the tumor suppressor gene WWOX is a new risk factor for differentiated thyroid carcinoma[J]. Int J Cancer,2011,129:2816-2824.

[7] Lange EM, Beebe-Dimmer JL, Ray AM, et al. Genome-wide linkage scan for prostate cancer susceptibility from the University of Michigan Prostate Cancer Genetics Project: suggestive evidence for linkage at 16q23[J]. Prostate, 2009,69:385-391.

[8] Higginbotham KS, Breyer JP, McReynolds KM, et al. A multistage genetic association study identifies breast cancer risk loci at 10q25 and 16q24[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2012,21:1565-1573.

[9] Matteucci E, Maroni P, Luzzati A, et al. Bone metastatic process of breast cancer involves methylation state affecting E-cadherin expression through TAZ and WWOX nuclear effectors[J]. Eur J Cancer, 2013,49:231-244.

[10] Lan C, Chenggang W, Yulan B,et al.Aberrant expression of WWOX protein in epithelial ovarian canner:a clinicopathologic and immunohistochemical study[J]．Int J Gynecol Pathol，2012,31(2):125-132.

[11] Aqeilan RI, Hagan JP, de Bruin A, et al. Targeted ablation of the WW domain-containing oxidoreductase tumor suppressor leads to impaired steroidogenesis[J]. Endocrinology, 2009,150:1530-1535.

[12] Ludes-Meyers JH, Kil H, Nunez MI, et al. WWOX hypomorphic mice display a higher incidence of B-cell lymphomas and develop testicular atrophy[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2007,46:1129-1136.

[13] Zhou YL, Li YC, Shou F, et al．Reversing effect of exogenous WWOX gene expression on malignant phenotype of primary cultured lung carcinoma cells[J]．Chin Med J(Engl),2010,123(5):615-620．

[14] 張繼平．抑癌基因 WWOX 和 p53 在結直腸癌中的表達及臨床意義[J]．天津醫藥，2012，40(8)：787-789．

[15] Chang NS, Doherty J , Ensign A, et al. WOX1 is essential for tumor necrosis factor, UV light, staurosporine, and P53-mediated cell death, and its tyrosine33-phosphorylated form binds and stabilizes serine 46-phoporylated P53[ J ]. J Biol Chem, 2005, 280 (52): 43100-43108.

Expression of WWOX protein and mutant type P53 protein in non-small cell lung cancer and its clinical significance

WangJun.

TheFirstHospitalofChuzhouCity,Chuzhou239000,China.

Objective To investigate the relationship between the expression and the clinicopathological factors of WWOX and P53 protein in the tissue of non-small cell lung cancer (NSCLC) and paracancerous tissues. Methods Immunohistochemieal staining methods were used to respectively detect the expression of WWOX and P53 protein in 51 cases of NSCLC and 20 cases of the same cases of paracancer tissues of NSCLC. Results The positive rates of expression WWOX and P53 protein was 25.49 % and 58.82% in NSCLC, whereas in adjacent normal lung tissues it was 85.0% and 10.0%.WWOX expression was strongly associated with tumor histologic and histologic grade, lymph node metastasis,smoking and pathological grade(P<0.05). The expression of WWOX was not related with Age, sex and tumor TNM stage (P>0.05). P53 expression was strongly associated with tumor histologic and histologic grade, lymph node metastasis, and TNM stage(P<0.05). The expression of WWOX was not related with Age, smoking, sex and tumor pathological grade(P>0.05). WWOX was negative relation with the expression of P53 in NSCLC carcinomatissues(r=-3.33，P<0.05). Conclusion The expression of wwox protein and P53 protein in NSCLC and paracanerous, there are statistical significantly differences. WWOX and P53 protein might play synergetic role in the process of carcinogenesis of NSCLC. Determination of their expression might be used to evaluate prognosis.

NSCLC； WWOX； P53； Immunohistochemistry

R734.2

A

1000-744X(2016)03-0246-03

2015-10-23)