細胞聯合生物支架治療脊髓損傷的研究進展

孫成龍 黃立佳 黃楊 鄒陽 王昌興?

細胞聯合生物支架治療脊髓損傷的研究進展

孫成龍 黃立佳 黃楊 鄒陽 王昌興?

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的發生已成為全球性的醫療難題，現今國內外研究的重點及熱點在于如何克服再生屏障，修復受損組織，促進脊髓再生。1987年正式提出組織工程學概念，其基本原理是將少量種子細胞體外培養擴增后，聯合生物材料，修復損傷脊髓組織，改善生理功能。目前眾多實驗室研究也致力于聯合生物支架與細胞，使其發揮互補協同作用，取長補短共同促進軸突再生和功能恢復。本文回顧了近年來以細胞載體為基礎復合組織工程支架在SCI修復中的具體應用及其優勢與局限性，旨在為進一步臨床研究提供理論依據。

1 學術背景

SCI不僅可以造成感覺及運動障礙，而且可以導致多系統功能紊亂，包括心血管系統、呼吸系統、消化系統和泌尿生殖系統［1］。世界范圍內患有SCI的患者約有2500萬，而且據報道每年病例新增人數已＞13萬［2］。SCI的病理生理機制是多因素的，包括血管破裂、局部缺血缺氧和水腫、炎癥因子滲出、自由基形成等，這些因素共同導致損傷區域內神經元破壞、軸突退化、髓鞘脫失、空洞和膠質瘢痕的形成［3］。

過去幾十年間，有關于SCI的研究呈爆發性增長，大量的實驗室研究都致力于向臨床實驗轉化［4］，從而指導臨床診治。然而現今針對脊髓橫斷患者的功能恢復尚無顯著有效的治療措施［5］。臨床上針對SCI現有的治療方法例如促神經生長藥物的應用，手術減壓，康復訓練和中藥熏洗等物理療法，而這些方法對軸突連續性中斷所導致的神經元靶源性營養供給減少和生理電信號及化學傳遞功能受損的作用甚小，因此雖有一定療效，但不能從本質上阻止病情發展。藥理學研究表明，大劑量強的松龍沖擊療法對于急性損傷有一定療效［6］，但是由于其副作用較明顯，在臨床上應用受到較大限制。因此針對SCI帶來的一系列問題，新的治療手段顯得尤為重要。

隨著近年來組織工程學的迅速發展，利用種子細胞移植修復受損神經為SCI的研究與治療提供了新思路，與此同時多種生物材料用于制成可移植細胞的載體系統或導管支架，其發揮橋梁作用治療SCI的研究與應用也受到業內人士的廣泛關注。大量實驗研究表明，具有生物相容性的支架作為細胞載體移植入宿主體內后，能夠為種子細胞提供一個相對良好穩定的環境，且有利于大量血管形成并長入支架內，能夠使移植的細胞獲取充分的養分并利于其代謝產物的排出。基于此，本文將對不同種類的細胞與支架聯合治療脊髓損傷的優勢及其局限性作一綜述，同時對支架承載細胞的聯合治療相比于其獨立移植是否更有助于脊髓損傷的恢復進行討論，旨在為進一步實驗室研究和臨床研究提供參考。

2 細胞聯合生物支架治療脊髓損傷

盡管分別以細胞和支架為基礎治療SCI的實驗基礎已趨于成熟，其單一療法仍然存在較多局限性。采用支架單一治療時，不能按照預期精確的調整支架性能，移植到體內的支架也不能替代受損細胞和組織達到良好的修復。另一方面，細胞單獨移植時無法重建脊髓組織復雜的構架及穩定性，亦不能誘導軸突再生［7］。聯合支架和細胞移植治療SCI不僅能克服諸多再生障礙，而且能發揮良好的協同作用利于損傷后功能的恢復，下面回顧了近年來最常見的聯合治療方法。

2.1 神經干細胞（NSCs） SCI模型中植入的NSCs可以替代神經元，促進髓鞘再生從而有利于功能恢復。近年來研究表明人工合成的多聚羥基乙酸（PGA），聚乳酸（PLA）及其共聚物（PLGA）作為細胞載體共同移植至SCI模型中具有廣泛的應用前景［8］。究其生物學基礎，現有研究表明NSCs聯合PLGA培養14d后，細胞存活并廣泛分布于支架孔隙中，細胞中＞70%為微管相關蛋白2（Map2）免疫陽性細胞，且突觸后密度蛋白95（PSD95），突觸蛋白-I（Synapsin-I）免疫染色顯示突觸結構形成，說明PLGA支架誘導了NSCs分化為神經元，有效建立了突觸連接［9］。JC［10］團隊用靈長類動物獼猴的NSCs與自制多鈦納米纖維支架共培養后移植入SCI大鼠模型中，電鏡下觀察NSCs在支架的誘導下分化成神經細胞，膠質細胞和少突膠質細胞，且運動功能評分（BBB）顯示聯合治療組相對于細胞組和支架組單獨治療，其后肢活動功能明顯提高，差異統計學意義（P＜0.05），而細胞組和支架組的評分未見顯著差異。

一些研究已證實天然聚合物充當生物支架可以對NSCs進行調節。比如，藻朊酸鹽海綿或凝膠能有效抑制脊髓橫斷損傷后星形膠質細胞的增生，減少瘢痕形成，有利于軸突的再生［11］。與大鼠海馬組織衍生出的神經球細胞共移植后，可觀察到細胞存活、分化、長距離遷移，并與宿主脊髓組織融為一體［12］。與之相似，纖維蛋白凝膠也能大幅度促進軸突和樹突再生［13］。

2.2 間充質干細胞（MSCs） MSCs已成為近年來公認理想的種子細胞之一，具有多分化潛能，經大量培養擴增，在特定的化學或生物誘導環境下可以分化成神經細胞、脂肪細胞、成骨細胞等。聯合生物材料也成為組織工程學的一種有效治療方法，旨在增加損傷部位細胞的移植效率與存活率。例如，人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）與PLGA共移植明顯增強了SCI后的功能恢復，可見損傷部位的神經絲蛋白陽性細胞密度增加［14］。在PLGA與小腸黏膜下層的復合支架（PLGA/SIS）上種植hBMSCs亦能起到誘導神經再生的作用［15］。另有研究將MSCs標記在具有三維立體結構的明膠海綿（GS）支架上，驗證了明膠海綿作為一種可靠的生物工程材料，在修復受損神經組織方面具有良好的細胞適應性和組織相容性［16］。Wang等［17］模擬脊髓的多孔三維結構制作了殼聚糖支架，聯合神經營養因子-3（NT-3）和BMSCs植入全橫斷大鼠脊髓損傷處，通過術后行為學測試，電生理和組織學評估證實了聯合治療相比于單純支架組治療更有利于損傷后的軸突再生和功能恢復。在臨床應用方面，Sherif M. Amr等［18］在14例慢性SCI導致截癱的患者身上應用腓腸神經作為斷端橋接，聯合殼聚糖-層粘連蛋白和BMSCs移植至損傷空洞處，顯示患者的運動及感覺水平均有不同程度的提高，根據美國脊髓損傷協會（ASIA）評分標準，運動功能的改善中，有2例患者提高了4個等級，另12例患者提高了2個等級；在感覺功能的提高方面，有2例患者提高了6個等級，5例患者提高了5個等級，3例患者提高了4個等級，4例患者提高3個等級。下肢肌群包括大腿部屈肌群、內收肌群、伸膝肌群以及踝背屈肌的力量也有不同程度的提高，這些結果與之前將未種植細胞的腓腸神經支架移植研究相比較具有顯著優勢，然而這種程度的功能恢復仍不足以使患者主動站立或行走，提示支架聯合細胞移植目前在臨床方面的應用處于初級探索階段，而其應用前景不可估量。

2.3 雪旺細胞 （SCs） SCs是促進外周神經損傷后修復的主要因素，因此人們將其應用于SCI后軸突與髓鞘再生的修復。實驗室研究證明SCs直接移植到受損脊髓損傷部位后，斷端接觸面上無明顯炎癥反應，且脊髓兩斷端之間可見髓鞘再生，然而其傳導功能恢復程度有限［19］，因為軸突的再生難以通過損傷處的囊性空腔或者膠質瘢痕，而聯合支架的應用使這一難題得到解決。曾有學者應用載有纖連蛋白、海藻酸鹽和新生兒SCs的聚羥基丁酸酯（PHB）導管植入脊髓半橫斷大鼠，發現軸突能夠再生并穿過脊髓植入物平面［20］，由此驗證支架的聯合應用彌補了細胞移植的眾多不足。Bamber等［21］將聚丙烯腈與聚氯乙烯（PAN/PVC）以60∶40的比例制成一種半透微管支架，其作用不僅可以引導軸突的再生方向，而且通過微管可以傳遞神經營養因子并限制瘢痕纖維侵入。SCs種植在支架上后觀察到來自脊髓近端及遠端方向的神經元軸突延伸入植入物中，并在兩斷端之間形成有效橋接，但是長入移植物的神經突觸不能或者僅極少數能夠通過遠端移植物的脊髓平面。Fouad等［22］也使用了類似的方法將SCs種植于60∶40的PAN/PVC孔徑里，結果可見BBB運動評分有了顯著提高，移植物內有血管長入，SCs誘導橋接的再生軸突數量亦可見增加。但由于PAN/PVC支架不可吸收，可能會對遠期神經再生有所限制，以及產生異物免疫反應。因此可吸收生物支架的應用有效的避免了不良反應，早在2001年就有研究應用SCs種植在聚乳酸制成圓柱狀支架上嵌在脊髓斷端之間，結果在支架分解前再生神經纖維的數量及髓鞘化較好，而隨著支架急劇降解，再生纖維數量開始減少，由此說明支架的幾何形態改變對于神經再生是有影響甚至是不利的。

2.4 嗅鞘細胞（OECs） OECs能夠顯著促進中樞神經系統內神經元的再生，并且減少神經凋亡，減輕膠質瘢痕的形成，同時分泌血管內皮生長因子等一系列營養因子，且有助于脊髓損傷部位的髓鞘再生和郎飛結的形成。這些特性使其成為聯合治療SCI的良好種子細胞。先前研究培養OECs并將其懸浮液注入脊髓受損組織中，發現再生軸突僅能覆蓋較小面積的病變組織，而與PLGA共培養移植后，具有生物結構相似的支架發揮了橋梁作用，使得OECs促進的軸突生長能夠覆蓋較大面積的受損組織。Bing-Cang Li等［23］在體外測試了PLGA支架與OECs的兼容性，顯示完全相容。二者的組合能夠顯著改善受損坐骨神經的結構和功能，并有效防止脊髓神經壞死。Novikova等［24］進行的一項體外研究測試了OECs與不同水凝膠之間的生物相容性。與藻朊酸鹽水凝膠結合，OECs呈現不規則的球形，且其代謝活動受到抑制，而在藻朊酸鹽中加入纖連蛋白后，細胞的增殖分化等代謝活動則明顯增強。當OECs與人工基底膜共培養時，細胞的增殖擴散受到明顯刺激并可觀察到其特有的細胞形態。另一體外實驗探究了納米纖維凝膠材料IKVAV多肽的自組裝及其與OECs的相容性。倒置顯微鏡結果顯示不管種植在支架2D還是3D的表面，OECs都能存活，遷移并粘附在支架上，且與多聚懶氨酸共培養相比，OECs的數量、生存能力和細胞形態無明顯差異［25］。Fengyu Qi 等結合了導電性聚吡咯與殼聚糖觀察其對于OECs的作用，結果顯示無論有無電刺激，聚吡咯/殼聚糖聚合物支架均利于細胞粘附、擴散和增殖。給予支架電刺激后，研究者們發現腦源性神經生長因子（BDNF）、神經生長因子（NGF）、神經細胞粘附分子（N-CAM）、血管內皮生長因子（VEGF）的表達及分泌均顯著提高，而神經突產物抑制劑A（NOGO-A）的分泌及表達水平與未加入電刺激時相比則明顯降低［26］。這一報道也證明了電刺激可以調節OECs的功能，包括細胞凋亡、細胞增殖和神經營養因子的釋放等，使得具有導電性質的高分子聚合物為組織工程學的進一步研究開辟了良好前景。Amaia Ferrero-Gutierrez等［27］為了測試脊髓損傷后大鼠運動功能的恢復情況，在損傷部位植入了新鮮血漿衍生的白蛋白支架與OECs混合物，結果顯示聯合支架與細胞的治療組大鼠與單純支架治療組相比較，不同時間點的BBB評分均顯著提高，另外，損傷部位聯合治療組的星形膠質細胞誘導的膠質瘢痕形成顯著減少，細胞內神經元和軸突的標記物表達量可見增多。

3 問題與前景

單純的細胞移植后軸突生長較紊亂，而生物支架的作用在于為近端新生的軸突提供有效支持與導向，為細胞生長提供三維的機械支撐并引導細胞的遷移、增殖、分化以及凋亡，且能保護新生軸突免受瘢痕組織侵害。然而支架的細胞移植可能引起機體免疫排斥反應，供體部位壞死，以及傳播疾病等不足，另外支架本身也有其不足，例如聚乳酸PLA導管的弱點在于過快水解，改良后的共聚物PLGA雖性質更優，但仍難以控制其本身降解速率，且制作塑型過程較復雜，體內降解的酸性產物對局部微環境可能產生不良影響。因此在SCI治療的相關實驗研究雖取得了巨大進步，但離臨床的廣泛應用仍有距離，臨床上可能面臨支架材料降解之后的細胞環境改變問題，不可降解材料術后二次取出問題，或是載體留置及崩塌問題等。客觀分析，結合生物支架與細胞的優點，盡可能克服或改善各自的不足，其前景仍良好。另外，如何降低移植后可能存在的免疫反應，使移植至缺損處的細胞定向分化為功能性結構所需的細胞仍是目前亟待研究的課題。

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國家自然科學基金項目（編號：81271355）

310000 浙江中醫藥大學第二臨床醫學院（孫成龍 黃立佳 黃楊）310000 浙江中醫藥大學附屬第二醫院（鄒陽 王昌興）

*通信作者