膠原在動脈粥樣硬化斑塊中的作用研究進展

劉娜 資曉宏?

膠原在動脈粥樣硬化斑塊中的作用研究進展

劉娜 資曉宏?

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種脂質堆積、炎癥細胞浸潤、細胞外基質增生為病理特征的慢性炎癥過程［1］。AS導致心腦血管意外在人類死亡原因中占重要地位，隨著動脈粥樣硬化研究的深入，動脈斑塊的穩定性在心腦血管疾病的致病機制的作用逐漸清晰，不穩定斑塊的突然破裂可直接栓塞下游的血管，裸露的含高凝物質的核心接觸血液能迅速形成血栓導致缺血事件發生［2］。研究表明頸內動脈存在粥樣斑塊者發生腦梗死的危險是不伴粥樣斑塊者的3倍，存在非鈣化斑塊及斑塊表面不規則者發生腦梗死的危險性增加［3］。在AS病變的不同階段斑塊展現出不同的結構和化學組成，斑塊的穩定性與覆蓋在脂核管腔面的斑塊纖維帽的組成與厚度及分布情況密切相關［4］。纖維帽的抗機械強度的能力越強，斑塊就越穩定，而在纖維帽的細胞外基質中，膠原是重要的構成成分，所以膠原的產生增多形成硬化斑塊是維持斑塊穩定性的重要因素［5］。目前膠原在動脈粥樣硬化斑塊形成中起的作用值得探討，本文結合國內外最新進展做一綜述。

1 膠原

膠原是最主要的細胞外基質成分，膠原蛋白是由三條肽鏈（α1、α2、α3）呈螺旋形纏繞而成的繩索狀分子。根據這三條肽鏈結構的不同，迄今已經發現了27種膠原，在動脈壁中其由內皮細胞、平滑肌細胞及成纖維細胞共同合成。I、III型膠原蛋白是粥樣斑塊的主要成分，其與AS的相關性研究已經有較多報道［6］。早在1987年Shekhonin及其同事［7］即提出各種類型膠原成分在動脈壁中的分布情況與AS的進展程度密切相關。有研究發現I型膠原占動脈壁膠原總量的2/3，是動脈內膜和外膜最主要的成分，且在動脈中膜明顯沉積，III型膠原占動脈壁膠原總量的比例隨I型膠原不斷蓄積與粥樣硬化的發展而有輕度下降［8］。近年有動物實驗進一步證實動脈粥樣硬化組家兔主動脈壁內I型膠原比正常對照組明顯增高［6］。但是Purushothaman等［9］發現糖尿病患者動脈粥樣硬化斑塊內III型膠原沉積量較非糖尿病患者的動脈斑塊內多。

膠原在動脈粥樣硬化中的作用包括構成粥樣斑塊的主要成分堵塞血管，參與斑塊的鈣化，促進血管內皮細胞遷移、增殖，促進脂質沉積、潴留，與血小板相互作用促進血小板聚集、血栓形成，此外膠原糖化可能促進動脈硬化的發

生發展。膠原纖維的結合受體主要有細胞膜表面的整合素（α1β1、α2β1）及盤狀結構域受體酪氨酸激酶受體（DDR1、DDR2）。

2 膠原與平滑肌細胞的增生和遷移

在AS的病變過程中，血管平滑肌細胞經歷從靜態收縮表型到增生合成表型的過渡，在這一過程中膠原起了關鍵作用。在斑塊的形成過程中，血管平滑肌細胞產生的膠原蛋白顯著增加，約占斑塊內總蛋白的60%。反過來由平滑肌細胞合成的膠原又通過受體介導的信息反饋來影響平滑肌細胞的表型及行為。血管平滑肌細胞的增生是影響動脈粥樣斑塊發生發展的重要成分，而I型膠原是血管平滑肌細胞增生的關鍵調節因素。Koyama及其同事在多聚體型I型膠原平板上接種平滑肌細胞發現，I型膠原通過上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制體p27Kip1和p21Cip1使得平滑肌細胞保持靜態［10-11］。在多聚體型I型膠原凝膠中懸浮培養的平滑肌細胞亦表現為生長抑制。還有體內試驗研究證實多聚體型I型膠原纖維具有抗細胞增生的作用［12］。相反，在單聚體型I型膠原平板或可溶性I型膠原懸液中培養接種平滑肌細胞，I型膠原能通過激活磷脂酶C與P12K途徑刺激細胞的增生。此外，可溶性I型膠原與血小板源生長因子通過PDGFRβ受體和整合素α2β1受體的相互交聯協同刺激細胞增生。VIII型膠原，膠原中的一種短鏈分子。在血管損傷或動脈粥樣硬化病變中，平滑肌細胞與巨噬細胞大量分泌VIII型膠原。平滑肌細胞通過DDR和整合素受體（α1β1、α2β1）與VIII型膠原粘附在一起。有人從野生型小鼠與VIII型膠原基因敲除小鼠分別獲得平滑肌細胞并培養發現，野生型細胞合成VIII型膠原并能掩蓋I型膠原，即使在多聚I型膠原環境中，平滑肌細胞亦能大量增生［13］。因此，不同類型的膠原或不同物理構象的膠原都能對平滑肌細胞的增生產生不同的影響。通過DDR1基因敲除小鼠模型，研究人員發現，DDR1在動脈損傷后的動脈內膜增生過程中起重要作用［14］。DDR1基因敲除細胞在I型膠原和Ⅷ型膠原環境中表現為細胞增生受到抑制、遷移速度減慢，同時MMPs活性下降。此外，DDR1基因敲除與DDR1基因正常小鼠相比，其動脈粥樣斑塊中平滑肌細胞聚集數量無明顯差別，但斑塊大小、巨噬細胞聚集數量較后者減少，而細胞外基質卻有顯著增加。因此，DDR1不是斑塊內平滑肌細胞浸潤的關鍵，但確實影響了細胞外基質的合成與積累。

血管平滑肌細胞從動脈中膜遷移至動脈內膜是動脈粥樣斑塊擴大形成斑塊核心的重要組成部分。其遷移過程包含粘附、播散、移位等多個步驟，每一個步驟均受到細胞外基質分子的調節作用。體外實驗發現平滑肌細胞能在I型膠原平板上移動，膠原的聚合狀態影響平滑肌細胞的遷移速度，細胞在單聚體型膠原纖維上的遷移速度比在多聚體型膠原纖維上細胞遷移速度更快。更深入的研究發現，多聚體型I型膠原能抑制平滑肌細胞多個基因的表達，其中包括在細胞粘附、調節細胞形狀及細胞運動中發揮重要作用的α-輔肌動蛋白［15］。與此類似，在多聚體型I型膠原懸液中培養的平滑肌細胞也表現為肌動蛋白結合蛋白合成、局部粘附受抑制，局部粘附點激酶磷酸化程度下降。因此，多聚體型I型膠原能抑制血管平滑肌細胞的遷移。

研究表明平滑肌細胞必須降解I型膠原才能跨越或侵入膠原凝膠［16］。膠原纖維的蛋白水解產物能影響平滑肌細胞的行為。細菌膠原酶降解產生的膠原片段能快速分散粘附聚集的平滑肌細胞集合體，促進細胞遷移與基質的釋放。I型膠原降解通過上調腱糖蛋白C間接促進平滑肌細胞的遷移與增生。膠原降解片段通過整合素受體（αⅤβ3）促進ERK1/2依賴性腱糖蛋白C的合成，腱糖蛋白C又刺激平滑肌細胞的增生與遷移。

3 膠原干預炎癥反應

從血流中招募單核細胞并累積至血管壁中是動脈粥樣硬化的早期事件。在血管內皮細胞下，單核細胞被激活成為巨噬細胞，然后吞噬脂質，分泌炎癥因子，同時還分泌蛋白酶，其中蛋白酶包括金屬基質蛋白酶（MMPs）、組織蛋白酶、血纖維蛋白溶酶。巨噬細胞逐漸分化從圓形漂浮細胞變成極化細胞，其能與斑塊內的細胞外基質相互作用，并在細胞基質中遷移。膠原在巨噬細胞的分化、遷移、炎癥細胞因子的產生及基質蛋白酶分泌等多方面調節了巨噬細胞的功能。細胞培養表明，I型膠原基質可誘導單核細胞行為及表型的顯著變化，附著于I型膠原使得單核細胞分化為巨噬細胞，促進其細胞播散及吞噬能力［17］。在膠原基質環境中，巨噬細胞產生和分泌更多的佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯超氧化產物和前列腺素E2。前列腺素E2通過EP2和EP4受體激活蛋白激酶A（PKA）和PKB/Akt途徑，反過來促進前列腺素A2的分泌。而前列腺素A2在動脈粥樣硬化早期對低密度脂蛋白堆積起關鍵性作用。巨噬細胞主要通過整合素受體、DDR、清道夫受體A三種膠原受體與膠原作用。一般情況下，整合素α2β1在巨噬細胞一般維持在低表達水平，但是在吞噬活動中整合素受體α1β1的表達上調，整合素α1β1的關鍵作用在一個載脂蛋白基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型中有所體現，有α1整合素缺陷的載脂蛋白基因敲除小鼠形成較小的動脈硬化斑塊，斑塊內巨噬細胞、T細胞含量較α1整合素正常的載脂蛋白基因敲除小鼠明顯減少。研究表明α1整合素有致動脈粥樣硬化和炎癥的作用。清道夫受體介導巨噬細胞與I型、III型膠原、糖化IV型膠原的粘附［18］，膠原通過清道夫受體調節巨噬細胞吞噬低密度脂蛋白的能力。DDRs還在單核細胞的活化及其分化的過程中起重要作用。過度表達DDR1α可促進巨噬細胞對膠原基質侵襲，而過度表達DDR1β可通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB途徑促進單核細胞分化和分泌細胞因子。有人通過DDR1基因及低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠建立的動脈粥樣硬化模型發現，DDR1基因敲除組小鼠形成的動脈硬化斑塊比DDR1基因正常組小鼠的動脈硬化斑塊小60%，且斑塊大小的減少與其斑塊內巨噬細胞堆積減少呈正相關，而且DDR1基因敲除組小鼠的MMP-2，9，14的表達減少，使得其不能產生足夠的蛋白裂解酶侵襲斑塊。Franco及其同事［19］進一步研究發現來自有DDR1基因缺陷小鼠的巨噬細胞對Ⅳ型膠原的粘附能力下降，同時，單核細胞趨化蛋白-1減少導致巨噬細胞對Ⅳ型膠原的侵襲力減弱。因此，膠原通過DDR1對吸引炎癥細胞至斑塊內起重要的作用。

4 膠原的分解

動脈硬化斑塊由富含膠原纖維的纖維帽覆蓋，纖維帽的堅固程度是斑塊穩定性的重要決定因素。斑塊破裂可導致下游血管栓塞，是急性心肌梗塞、腦梗死的重要病因，且其致殘率與病死率較高。導致斑塊破裂的重要因素是基質金屬蛋白酶對膠原纖維的裂解作用。MMP通過降解細胞外基質為平滑肌細胞及炎癥細胞的遷移排除障礙，并調節細胞外基質的累積影響斑塊的大小。不少研究已經發現不同MMP在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中起不同的作用。有人通過MMP-2基因敲除動脈硬化小鼠模型發現其動脈粥樣斑塊大小減小，同時斑塊內平滑肌細胞及炎癥細胞浸潤減少［20］。MMP-9基因敲除小鼠模型亦得到類似結果，而且MMP-9過度表達使斑塊內出血增多，纖維帽變薄。因此，MMP-2、MMP-9在AS斑塊形成過程中起促進作用，并使得斑塊不穩定。相反，MMP-3基因敲除小鼠較MMP-3基因正常小鼠卻形成了更大的含膠原纖維更多的斑塊。Lemaitre及其同事發現過度表達MMP-1使得動脈斑塊減少，膠原沉積減少［21］。因此MMP-1、MMP-3通過抑制細胞外基質的堆積對動脈及粥樣斑塊的穩定性起保護作用。還有人研究MMP-12與MMP-13基因敲除動脈粥樣硬化小鼠模型發現，MMP-12與MMP-13并不影響斑塊大小或斑塊內細胞的堆積［22-23］。但是MMP-13基因敲除小鼠的斑塊表現為纖維帽內膠原含量增多，膠原纖維增粗［23］。

5 總結

綜上所述，膠原纖維促進血管平滑肌細胞增生遷移，反過來合成產生更多的膠原纖維。另一方面，膠原纖維刺激單核細胞轉化為巨噬細胞，并增強其吞噬低密度脂蛋白的能力與蛋白酶分泌能力。蛋白酶再促進膠原的降解，膠原的降解又有助于上述細胞的遷移增生，如此循環，膠原在動脈粥樣硬化斑塊的形成過程中起著重要的作用。

［1］ Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32(9):2045-2051.

［2］ Stansby G, Macdonald S, Allison R, et al. Asymptomatic carotid disease and cardiac surgery consensus. Angiology, 2011, 62(6):457-460.

［3］ Kitamura A, Iso H, Imano H, et al. Carotid intima-media thickness and plaque characteristics as a risk factor for stroke in Japanese elderly men. Stroke, 2004, 35(12):2788-2794.

［4］ Yla-Herttuala S, Bentzon JF, Daemen M, et al. Stabilisation of atherosclerotic plaques. Position paper of the European Society of Cardiology (ESC) Working Group on atherosclerosis and vascular biology. Thromb Haemost, 2011, 106(1):1-19.

［5］ Wang KY, Tanimoto A, Sasaguri Y. Extracellular matrix and atherosclerosis. J UOEH, 2010, 32(2):195-203.

［6］ Hongyan Wang JZ, Aiqun Ma, Xinjun Lei, et al. The experimental study of relation between type I collagen, NF- KB, VCAM-1 and atherosclerosis. Journal of US-China medical science, 2006, 3(5):15-19.

［7］ Shekhonin BV, Domogatsky SP, Idelson GL, et al. Relative distribution of fibronectin and type I, III, IV, V collagens in normal and atherosclerotic intima of human arteries. Atherosclerosis, 1987, 67(1):9-16.

［8］ Murata K, Motayama T, Kotake C. Collagen types in various layers of the human aorta and their changes with the atherosclerotic process. Atherosclerosis, 1986, 60(3):251-262.

［9］ Purushothaman KR, Purushothaman M, Muntner P, et al. Inflammation, neovascularization and intra-plaque hemorrhage are associated with increased reparative collagen content: implication for plaque progression in diabetic atherosclerosis. Vasc Med, 2011, 16(2):103-108.

［10］ Koyama H, Raines EW, Bornfeldt KE, et al. Fibrillar collagen inhibits arterial smooth muscle proliferation through regulation of Cdk2 inhibitors. Cell, 1996, 87(6):1069-1078.

［11］ Tanner FC, Boehm M, Akyurek LM, et al. Differential effects of the cyclin-dependent kinase inhibitors p27(Kip1), p21(Cip1), and p16(Ink4) on vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation, 2000, 101(17):2022-2025.

［12］ Tanner FC, Yang ZY, Duckers E, et al. Expression of cyclindependent kinase inhibitors in vascular disease. Circ Res, 1998, 82(3):396-403.

［13］ Adiguzel E, Hou G, Mulholland D, et al. Migration and growth are attenuated in vascular smooth muscle cells with type VIII collagen-null alleles. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(1):56-61.

［14］ Hou G, Vogel W, Bendeck MP. The discoidin domain receptor tyrosine kinase DDR1 in arterial wound repair. J Clin Invest, 2001, 107(6):727-735.

［15］ Ichii T, Koyama H, Tanaka S, et al. Fibrillar collagen specifically regulates human vascular smooth muscle cell genes involved in cellular responses and the pericellular matrix environment. Circ Res, 2001, 88(5):460-467.

［16］ Kanda S, Kuzuya M, Ramos MA, et al. Matrix met alloproteinase and alphavbeta3 integrin-dependent vascular smooth muscle cell invasion through a type I collagen lattice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20(4):998-1005.

［17］ Wesley RB, Meng X, Godin D, et al. Extracellular matrix modulates macrophage functions characteristic to atheroma: collagen type I enhances acquisition of resident macrophage traits by human peripheral blood monocytes in vitro. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1998, 18(3):432-440.

［18］ Gowen BB, Borg TK, Ghaffar A, et al. The collagenous domain of class A scavenger receptors is involved in macrophage adhesion to collagens. J Leukoc Biol, 2001, 69(4):575-582.

［19］ Franco C, Britto K, Wong E, et al. Discoidin domain receptor 1 on bone marrow-derived cells promotes macrophage accumulation during atherogenesis. Circ Res, 2009, 105(11):1141-1148.

［20］ Kuzuya M, Nakamura K, Sasaki T, et al. Effect of MMP-2 deficiency on atherosclerotic lesion formation in apoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(5):1120-1125.

［21］ Lemaitre V, O'Byrne TK, Borczuk AC, et al. ApoE knockout mice expressing human matrix met alloproteinase-1 in macrophages have less advanced atherosclerosis. J Clin Invest, 2001, 107(10):1227-1234.

［22］ Luttun A, Lutgens E, Manderveld A, et al. Loss of matrix met alloproteinase-9 or matrix met alloproteinase-12 protects apolipoprotein E-deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth. Circulation, 2004, 109(11):1408-1414.

［23］ Deguchi JO, Aikawa E, Libby P, et al. Matrix met alloproteinase-13/collagenase-3 deletion promotes collagen accumulation and organization in mouse atherosclerotic plaques. Circulation, 2005, 112(17):2708-2715.

310016 浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院下沙院區（劉娜）410000 中南大學附屬湘雅三醫院（資曉宏）*通信作者