檢測(cè)牛奶中布魯氏菌套式PCR方法的建立

欒云艷，林紅麗，侯喜林

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

檢測(cè)牛奶中布魯氏菌套式PCR方法的建立

欒云艷，林紅麗，侯喜林

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

為檢測(cè)牛奶中的布魯氏菌，通過(guò)對(duì)布魯氏菌外膜蛋白31 kDa的一段基因進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，建立從臨床奶樣中檢測(cè)布魯氏菌的方法。改進(jìn)了奶樣中布魯氏菌基因組DNA的提取方法，通過(guò)正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化了套式PCR試驗(yàn)的反應(yīng)條件，優(yōu)化后的一擴(kuò)PCR反應(yīng)條件為：退火溫度56.4℃，Mg2+濃度1.5 mM，rTaq酶0.2 μL，引物0.3 μM，dNTP濃度0.2 mM；二擴(kuò)PCR反應(yīng)條件為：退火溫度53.3℃，Mg2+濃度1.5 mM，rTaq酶0.25 μL，引物0.4 μM，dNTP濃度0.1 mM。其敏感性為8 CFU·mL-1，比細(xì)菌分離試驗(yàn)敏感1 000倍；與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、隱秘桿菌和克雷伯氏菌均無(wú)交叉反應(yīng)；與試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)布魯氏菌病的陽(yáng)性符合率是100%，陰性符合率是86.36%。試驗(yàn)建立的套式PCR方法可用于檢測(cè)奶樣中布魯氏菌。

布魯氏菌；套式PCR；奶樣；奶牛

布魯氏菌病（Brucellosis）于1859年由Morston首次報(bào)道[1]，是目前世界上流行最廣、危害最大的人獸共患病之一[2]，給世界的畜牧業(yè)以及人類(lèi)的健康帶來(lái)巨大的威脅，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列為需要通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病[3]。

傳統(tǒng)的診斷方法有很多，包括平板凝集反應(yīng)、試管凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)[4]等，上述方法均可檢測(cè)布魯氏菌病，而且操作較方便，但是敏感性不理想，實(shí)際臨床操作時(shí)往往需要多種方法結(jié)合應(yīng)用[9]。PCR技術(shù)[10]是快速、敏感的病原學(xué)診斷技術(shù)，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。自1990年，F(xiàn)ekete等[5]最早利用PCR的方法擴(kuò)增了布魯氏菌S19菌株的43 kDa蛋白的基因，并證實(shí)了他們研究的這種PCR方法擴(kuò)增布魯氏菌外膜蛋白基因的特異性和敏感性以來(lái)，國(guó)內(nèi)外便有很多關(guān)于PCR方法的報(bào)道。……