成骨不全14種長鏈非編碼RNA差異表達分析*

1.濟南大學、山東省醫學科學院醫學與生命科學學院 （山東 濟南 250022）

2.山東省醫學科學院 衛生部生物技術藥物重點實驗室 山東省罕少見病重點實驗室 山東省醫藥生物技術研究中心 （山東 濟南 250062）

3.天津市武清區人民醫院骨三科 （天津 301700）

4.山東省立醫院 （山東 濟南 250021）

滕元偉1,2任秀智3王延宙4張宇昂1,2韓振忠1,2韓金祥2魯艷芹2

成骨不全14種長鏈非編碼RNA差異表達分析*

1.濟南大學、山東省醫學科學院醫學與生命科學學院 （山東 濟南 250022）

2.山東省醫學科學院 衛生部生物技術藥物重點實驗室 山東省罕少見病重點實驗室 山東省醫藥生物技術研究中心 （山東 濟南 250062）

3.天津市武清區人民醫院骨三科 （天津 301700）

4.山東省立醫院 （山東 濟南 250021）

滕元偉1,2任秀智3王延宙4張宇昂1,2韓振忠1,2韓金祥2魯艷芹2

目的研究14種長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）在成骨不全骨組織中的表達。方法采用先天性骻關節脫位患者骨組織作為對照，應用RT-qPCR分析成骨不全骨組織中14種lncRNA(ATB、EBIC、HEIH、hLACR1、H0TAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC、LSINCTS 、Nbla10727、Nbla12061、PRNCR1與UC.388)的表達，使用REST-2009軟件進行數據統計分析。結果與對照組相比，14種lncRNA中僅PRNCR1表達下調并具有顯著性差異；ATB、EBIC、H0TAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC等7種lncRNA表達差異均小于2倍，LSINCTS表達下調，HEIH、hLACR1、Nbla10727、Nbla12061與UC.388等5種lncRNA表達上調，但均無統計學意義。結論PRNCR1在成骨不全骨組織中低表達，其在成骨不全疾病的功能尚有待于進一步研究。

成骨不全；lncRNA；骨組織；PRNCR1

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類轉錄本長度200～100,000個核苷酸的RNA，它們無編碼蛋白質的能力或很少有編碼蛋白質的能力[1]。lncRNA可通過表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等途徑調控相關靶基因的表達[2]。

隨著人類基因組內越來越多的lncRNA被發現，lncRNA與神經系統形成[3]、心血管形成[4]以及癌癥發生、發展[5]之間的關系也隨之被報道。并且，其表達水平與疾病的發生發展階段有緊密聯系[5]。成骨不全(osteogenesis imperfecta ,OI)是一類Ⅰ型膠原蛋白合成和代謝障礙引起的遺傳性結締組織病[6,7]。主要臨床表現為易骨折、骨質疏松，部分患者會伴有藍鞏膜、牙本質發育不全、聽力下降、肌肉薄弱、關節韌帶松弛等癥狀[8]。本研究擬分析14種長鏈非編碼RNA在成骨不全患者骨組織中的差異表達，為研究骨相關lncRNA及其功能奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料液氮、無水乙醇、異丙醇、氯仿(國藥集團化學試劑有限公司)、dNTP Mixture，10mM each(Takara)、Random Primers 50pM(Takara)、5×PrimeScript Buffer(Takara)、PrimeScript ⅡReverse Transcriptase 200U/ul(Takara)、DEPC、Trizol(Invitrogen)、SYBR Green熒光定量試劑盒(Roche)

1.2 方法經山東省醫學科學院倫理委員會通過，本實驗在天津市武清區人民醫院和山東省立醫院共收集被確診的成骨不全患者和先天性髖關節脫位患者術中廢棄的骨組織樣本各9例.其中，成骨不全患者平均年齡在7歲，5男4女。先天性骻脫位患者平均年齡6.8歲，5男4女。

1.2.1 骨組織總RNA提取：采用Trizol試劑提取總RNA，RNase- free water溶解RNA，測定RNA純度和濃度，A260/A280比值均在1.8-2.0之間。

1.2.2 逆轉錄反應：采用兩步法，總反應體系為20μL。第一步：反應體系為10μL，其中RNA 2μg，Random Primers（50pM）1μL，dNTP Mixture(10mMeach)1μL，用RNase free water補足至10μL。反應程序：65℃ 5min，冰上急冷2min以上。第二步：Template RNA/Primer mixture 10μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScriptⅡ Reverse Transcriptase(200U/ μL)1μL，Rnase Inhibitor(40U/μl)0.5μL，RNase free water 4.5μL。反應程序：30℃10min，42℃ 60min，70℃15min[9]。

1.2.3 qPCR反應：反應體系為10μL。包括cDNA 1μL，2×MIX 5μL，上下游引物各0.4μL，RNase free water補足至10μL。β-actin作為內參，引物序列為：上游5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′，下游5′-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′。定量PCR反應程序：95℃預變性5min，擴增反應95℃10s，60℃10s，72℃15s，共45個循環。

1.3 數據分析實驗中所有數據均為三次重復lncRNA之間差異分析是由REST-2009(版本2.0.13)處理，采用隨機性檢測方法。

2 結 果

14種lncRNA表達散點圖如圖1所示，圖2為lncRNA的相對表達量，結果表明ATB、EBIC、HOTAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC等7種lncRNA表達差異均小于2倍；HEIH、hLACR1、Nbla10727、Nbla12061、UC.388等5種lncRNA在成骨不全骨組織中表達上調，上調幅度在2.68-7.32倍之間，但無統計學差異；LSINCTS、PRNCR1等2種lncRNA表達下調，其中PRNCR1表達(P值＜0.05)，具有統計學差異。

3 討 論

圖1 成骨不全骨組織14種lncRNA相對表達分析散點圖。圖2 成骨不全骨組織14種lncRNA相對表達。

lncRNA較編碼蛋白質的RNA研究開始較晚，隨著lncRNA研究的深入，越來越多的lncRNA被發現。lncRNA的研究多在腫瘤中報道，關于骨相關疾病報道較少。但是有與lncRNA關聯基因突變而引起骨相關疾病的研究，例如，UC.388的相關基因TCF12[10]，而TCF12基因發生突變會引起新生兒顱縫早閉[11]；LOC285194缺失會引起腫瘤抑制基因(編碼的邊緣系統相關膜蛋白)拷貝數的改變，從而引起骨肉瘤的發生，并且LOC285194可以通過調控凋亡和細胞轉錄等方面促進成骨細胞增殖[12]。

本研究探討了HOTAIR等14種lncRNA在成骨不全患者骨組織中的表達情況，發現PRNCR1低表達，但仍然需要后續的進一步擴大樣本以及血樣樣本的驗證。目前關于PRNCR1的研究多限于腫瘤研究，通過siRNA降低PRNCR1表達可抑制前列腺癌細胞生長,同時反式激活雄激素受體，表明PRNCR1可能通過調控雄激素受體活性來影響前列腺癌的發生、發展[13]。在結腸直腸癌中，PRNCR1下降會使處于GO/G1細胞比例減少，處于S期的細胞明顯增加，從而促進癌細胞的增值[14]。PRNCR1的低表達在成骨不全中的作用尚有待于進一步研究。

另外，該研究中所差異變化沒有顯著性意義的一些lncRNA有一些在腫瘤組織中有差異表達。例如，HOTAIR在乳腺癌細胞中高表達，誘導全基因組重新定位起始復合物2，導致H3K27甲基化和改變基因表達模式，增加了侵襲性和轉移性[15]。

成骨不全作為遺傳性結締組織疾病，具有表型與基因型異質性，致病基因數量多且致病分子機制復雜多樣。但是絕大多數成骨不全患者是由于I型膠原蛋白結構基因COL1A1和COL1A2基因突變所致[16]。對成骨不全lncRNA的分析，能為該類疾病的分子標記物以及機制的研究奠定基礎。

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The Differential Expression of 14 Kinds of Long Non-coding RNAs in Osteogenesis Imperfect*

TENG Yuan-wei, REN Xiu-zhi, WANG Yan-yu, et al., School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong; Academy of Medical Sciences, Jinan 250022,China

ObjectiveTo explore the differential expression of 14 kinds of long non?--coding RNAs in bone tissues derived from osteogenesis imperfecta patients.MethodsRT-qPCR was performed to detect the expression level of 14 Kinds of lncRNAs including ATB, EBIC, HEIH, hLACR1, HOTAIR, PVT1, LET, Loc285194, SRHC, LSINCTS, Nbla10727, Nbla12061, PRNCR1 and UC.388 in bone tissues derive from osteogenesis imperfect (OI) patients who received corrective surgery. Bone tissues from developmental dysplasia of the hip (DDH) were used as control. REST-2009 was performed to analyze theResults.ResultsThe expression of PRNCR1 was signifcantly down-regulated in OI bone tissues. There’s no differential expression was observed in other thirteen lncRNAs, though the expression of HEIH, hLACR1, Nbla10727, Nbla12061 and UC.388 were up-regulated and LSINCTS was down-regulated. The expression of ATB,EBIC, HOTAIR, PVT1, LET, Loc285194 and SRHC was less than 2-fold of DDH control.Conclusions Low expression of PRNCR1 was observed in bone tissue from OI patients. The functions of PRNCR1 in OI need further study.

Osteogenesis Imperfecta; IncRNA; Bone Tissue; PRNCR1

R319

A

中國罕見疾病防治研究與示范(2013BAI07B00)

2016-04-08

滕元偉，男，藥學專業，碩士研究生，主要研究方向：成骨不全相關lncRNA表達差異篩選

魯艷芹

D0I:10.3969/j.issn.1009-3257.2016.02.021