去雙前肢大鼠腰椎間盤退變模型構造的研究進展

陶其杰 朱杭 潘浩

去雙前肢大鼠腰椎間盤退變模型構造的研究進展

陶其杰 朱杭 潘浩

椎間盤退行性變（IVDD）是椎間盤組織在多種原因作用下發生的生物變性，從而引起椎間盤組織結構特性和力學的改變，導致椎間盤突出、椎管狹窄、脊柱不穩等臨床常見疾病［1］，是引起下腰痛的主要原因。研究表明，＞50歲的人群中，97%存在椎間盤退變的表現。目前對該疾病的生物學機制尚未明確，因此利用動物模型研究其退變機制，同時也為尋找有效的治療和預防措施提供一條重要途徑。雖然現有的四肢動物模型在某種程度上可以模擬椎間盤退變的病理過程，但僅對諸多影響因素中的一部分進行研究，并不符合人類椎間盤的退變機制［2-7］。根據已有文獻報道，大鼠去雙前肢誘導直立模型（下文采用“雙足鼠”替代）是目前國際上公認的一種經典的實驗動物模型，取得一定的研究效果，本文對雙足鼠的研究進展及其前景作一綜述。

1 背景材料

目前已報道的椎間盤退變動物模型有數十種，主要分為生物力學改變、結構破壞、自發退變型和全身疾病型。但大部分模型均未體現致退變的首要因素—重力作用，而那些通過對動物脊柱進行軸向加壓誘導出退變的模型也與人體椎間盤生理性情況不符［2-7］。此外，人體椎間盤一直處于上部位結構的垂直載荷及復合運動時（屈伸、側屈及旋轉）所產生多種應力的作用下，易造成椎間盤擠壓和磨損。這種生物力學及運動學特點是人類脊柱區別于爬行動物的關鍵，也是構建椎間盤退變動物模型的難點。對此，制備與人類脊柱的運動學及生物力學特點相似的動物模型顯得尤為重要。Coff等［8］在 1957 年首次報道雙足鼠模型的建立，該模型大鼠通過模仿人類直立狀態下的生活方式，使其腰椎局部受力情況更接近于人類。此后，Higuch等［9］研究發現雙足鼠髓核的改變與人髓核在增齡上的改變相似。Cassidy等［10］則從直立大鼠的椎旁肌形態上進行闡述，發現大鼠的腰肌和多裂肌均發生肌纖維的轉變。另外，部分大鼠出現腰椎間盤突出及椎管狹窄等情況。吳靖平等［11］發現雙足鼠由于活動行為的改變，腰椎開始承受體重的應力，導致其髓核組織發生嚴重的退變，脊索細胞、軟骨樣細胞發生變化，這與人類椎間盤的細胞退變規律相符。王衛明等［12］對雙足鼠術后9～12個月進行組織學及放射影像學檢查，發現模型大鼠的椎間盤出現退變，且與人類椎間盤退變規律基本一致。也證實力學因素對椎間盤生物學性質的改變起到較明顯的作用。

雖然上述實驗研究在退變機制上模擬了人體椎間盤，但實驗動物均為乳鼠，建模成功率并不高，且存在建模術后飼養難度較大等不足［11］。為獲得更為合理的建模時機及相對較高的建模成功率，邱貴興等［13］分別采用為3d齡組、3周齡組和1個月齡組大鼠進行建模，發現3組雙足鼠日均累計動態站立時間無顯著性差異；其中1個月齡雙足鼠較早出現直立活動，具有較快的適應能力，達到比其他建模時間更好的效果，且1個月齡大鼠無術后死亡、因饑餓死亡等情況發生。

隨后，有學者［14-15］通過采用4周齡大鼠進行建模，分別在第5、7、9個月觀察直立的姿勢對腰椎間盤影響，組織學結果分析表明，椎間盤發生退行性改變，纖維環破碎、軟骨終板膠原蛋白結構出現紊亂、椎間盤高度丟失。該研究還指出體重與退變無統計學意義。國內學者［16］在進一步研究中發現直立模型大鼠的腰椎間盤存在病理改變，包括CollagenⅩ上調，CollagenⅡ表達下調，纖維環出現破裂，椎間盤高度降低，椎體軟骨終板鈣化，基質金屬蛋白酶表達增強。

Moravec等［17］提出置疑，其認為不同實驗室飼養的雙足鼠模擬人類直立姿勢的評定標準存在差異。Cassidy等［10］通過對Coff技術的改良，將新生大鼠的前肢用棉線結扎，通過食物誘導直立活動，在術后14～18個月通過影像學檢查發現其腰椎出現楔形變化，但僅有20%的雙足鼠發生椎間盤退變。Bailey等［18］對雙足鼠和正常大鼠進行全天24h的連續行為記錄后，指出模型大鼠“直立”時間并不多于正常大鼠。由此可見，雙足鼠模型尚未能完全模擬人類脊柱運動機制；其次，漫長的實驗周期和較低的成功率等弊端限制了其推廣應用。

為提高雙足鼠直立姿勢持續時間，邱貴興等［19］對雙足鼠術后直立姿勢相關事件與相應直立持續時間進行統計學分析，指出雙足鼠直立姿勢是一個被動過程，食物及飲用水的高度是其盡早站立的主要誘因。另外，通過間斷提高食物高度，可以增加雙足鼠直立姿勢的效能，但這種相關性隨增齡逐漸減弱。

2 生物力學

椎間盤退變是一種由細胞生物學和生物力學互相作用產生的病理過程。現有研究表明載荷在生理或病理狀態下調控椎間盤細胞的生物學行為和基質代謝方面起著重要作用［20-21］。Stokes等［22］發現高頻率靜態和動態的壓力可以產生細胞凋亡、增加代謝基因的表達、增加酶活性、改變結構性質。Gilbert等［23］研究指出椎間盤在周期性高應力作用下，會引起椎間盤基質分解增加、合成減少，進而導致椎間盤退變。Sowa等［24］對體外椎間盤纖維環細胞牽拉實驗表明：椎間盤組織基質代謝的調節與載荷的方式、頻率、幅度、時間及組織退變有關。張德宏等［25］采用 Flexcell4000 牽張系統對體外培養的髓核組織分別予以施加牽張應變為 2%和 10%、頻率為1.0Hz，時間為 2 h 和 12 h 的周期性牽張，發現：（1）2%牽拉力對肌動蛋白骨架形成的應力纖維影響不是很明顯，10%牽拉可以促進肌動蛋白骨架明顯解聚。（2）2%牽拉促進合成代謝，使Aggrecan mRNA表達上調，使基質金屬蛋白酶 2（MMP-2）mRNA和組織基質金屬蛋白酶抑制劑2（TIMP-2）mRNA表達下調，從而達到二者動態平衡。（3）10%牽拉對 Aggrecan 無影響。MMP-2 上調、TIMP-2下調與牽拉時間無明顯相關性。最后得出周期性牽張可以在基因水平上對纖維環細胞 Aggrecan、MMP-2和TIMP-2基因進行調節，通過調節肌動蛋白骨架從而對力學刺激產生響應。

Wuerta等［26］分別將人和牛髓核細胞培養在滲透壓為300mOsm/kg，400 mOsm/kg 和500mOsm/kg 的培養基中，通過改變培養基的滲透壓，發現隨著滲透壓的升高髓核細胞聚蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達量逐漸上升，而Ⅰ型膠原的表達量則受到抑制。Neidlinger-Wilke 等［27］從髓核細胞中的基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）mRNA 、聚蛋白聚糖兩方面進行研究，結果顯示隨著培養基滲透壓的增加，聚蛋白聚糖表達上升，MMP-3mRNA表達量出現下降。MMP-3是髓核細胞外基質降解的主要酶類，與椎間盤退變有著密切聯系，能夠降解層黏連蛋白、蛋白多糖、纖維連接蛋白等多種細胞外基質成分［28］。

3 操作方法

根據已報道的造模案例，目前大致可以分為2種：（1）傳統的截肢造模：①乳鼠：置4℃冰箱低溫處理12～15min后，用絲線結扎對肱骨近段及尾部進行結扎，然后截去雙前肢。3周齡后移走母鼠開始固體飼料喂養。在此后的飼養過程中，每周對大鼠麻醉后測量身長來調整食物及飲水源的高度，誘導大鼠雙后肢站立，以此訓練大鼠的直立活動。②4周齡大鼠：鹽酸氯氨酮 0.1g/kg行腹腔注射麻醉，將大鼠腋下備皮、碘伏消毒，取上臂中上1/3處橫向切開皮膚，逐層剝離，暴露三角肌下血管神經束，予以絲線結扎，再用組織剪剪斷肌肉、血管和神經，用咬骨鉗咬斷肱骨，碘伏擦拭后逐層縫合，最后大腿內側予以青霉素肌注。術后飼養同乳鼠。（2）臂叢神經離斷造模：采用雙前肢離斷容易遭實驗動物倫理學挑戰，肖軍等［29］打破倫理困境，對肩胛間區行后正中切口，沿肩胛骨內側緣逐層剝離菱形肌和斜方肌部分肌束，保留肩胛提肌。然后向外牽開肩胛骨，離斷前鋸肌止點，顯露臂叢神經主干及其分支，腋動靜脈，并用神經剝離子鈍性分離，將橈神經、正中神經、尺神經、腋神經及胸前神經分支離斷。碘伏消毒后，逐層縫合。該方法可實現大鼠雙前肢廢用、肩關節功能運動喪失，使上肢扶持、爬行等功能缺失，達到與傳統經典的截肢手術相似的效果。

4 優勢及不足

雙足鼠誘導腰椎間盤退行性變是目前國際上公認的一種經典的方案，其顯著優點是：（1）雙足鼠可以模仿人類直立行走過程中腰椎局部受力情況，更接近人腰椎間盤退變的發病機制，符合緩慢退變的特點。（2）大鼠具有廉價、易飼養、抗病能力強等優點。（3）大鼠椎間盤在解剖結構上與人類椎間盤極為類似［30］。（4）具有較強的可操作性［31］。顧韜等［31］認為雙足鼠的造模需要注意以下問題：（1）雙足鼠模擬人類直立姿勢的評定標準存在差異。（2）受到倫理學約束。（3）動物模型重復性中等，可調控性差，損傷大、投入大、干擾因素多。（4）漫長的實驗周期和較低的成功率等弊端限制了其推廣應用［17-18］。

5 前景展望

雙足鼠相比于傳統的四肢動物模型，更貼近人類脊柱活動的生物形態，更符合人類退變性脊柱疾病的發展規律，是一種可行性較高的造模方法。但漫長的實驗周期及在此期間產生的巨大投入，較其他造模方案并無明顯優勢，這也在一定程度上限制其推廣應用。另外，雙足鼠直立姿勢的評定標準還存在差異。因此，探索能夠延長雙足鼠的站立時間的新方法，縮短實驗周期以及制定統一的直立姿勢評定標準，這將是脊柱外科動物實驗研究的新方向。

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310053 浙江中醫藥大學第三臨床醫學院（陶其杰）

310007 杭州市中醫院（朱杭 潘浩）