石墨烯在生物醫學中的應用*

魏麗君 曹均凱

由于腫瘤切除、骨骼畸形、骨折及感染等造成的大塊骨缺損，使其快速愈合及重建對于骨組織再生來說比較困難，若發展該領域則需要能使細胞附著、增殖和分化[1-2]的基質，將幾種不同的材料復合后，可引發、刺激并維持一系列反應，最終使得細胞分化并生成骨。例如，膠原蛋白雖可為細胞的生長和分化提供適宜表面[3]，但其機械性能差且容易產生免疫反應[2]，因此，具有理化性能可調的水凝膠可為干細胞的命運起到積極引導作用，但它們有可能會缺乏細胞特異性的生物活性。針對干細胞研究來說，具有內在特性的材料在維持細胞的生長和誘導其分化方面有著巨大潛力。

石墨烯是二維碳原子平面結構，是已知最輕的、最薄的，也是強度最高的材料[4]。由于石墨烯極易官能化，故可在生物醫學的應用中開辟新途徑(例如，生物傳感器，用于藥物和基因遞送以及癌細胞成像等)[5-7]。石墨烯可從較純的石墨中合成且表面可調節，它已成為間充質干細胞(MSCs)、神經干細胞、誘導多能干細胞等貼壁細胞用于實驗的基質[5,8]。因石墨烯具有較高的機械強度和導電性，從而為新的DNA測序技術提供支持，并用于葡萄糖、血紅蛋白生物傳感器和膽固醇水平方面的研究[9,10]。在石墨烯合成和功能化的進展中，進一步探索其在藥物和基因傳遞以及在組織工程中的潛在應用[6]。

1.石墨烯及其特性

石墨烯屬于純芳香族碳系統，其特性是在室溫下具有高電子遷移率[11]，且具有優異的熱和化學穩定性[12]。它幾乎透明，吸光率僅約2.3%，肉眼稍微可見[13]。可通過以下方法獲得不同形式的石墨烯。機械剝離法，也被稱為“透明膠帶”技術，是用膠帶將微米尺寸的石墨烯薄片從石墨晶體中剝離[14]；氧化還原法，以石墨為原料采用強酸將其氧化，在單個的石墨烯片之間插入氧原子[15]；化學氣相沉積法(CVD法)[16]，這是一種可通用和可擴展的方法，此法用于生產大規模和高質量的石墨烯。不同的方法所產生的石墨烯具有不同數目的層和/或化學基團。

氧化石墨烯(GO)是天然石墨的高度氧化形式，是新穎的二維納米材料。它具有良好的生物相容性和低毒性，由于在片層邊緣含有含氧基團，這種兩親性化合物可表面官能化，并且可在水溶液中分散，官能化的GO可以改變其屬性，因此，修飾后的GO可用于許多生物應用中。

2.石墨烯的毒性

判斷一種材料對于生物體是否有毒性是生物醫學應用最重要的標準。有研究結果顯示，山羊來源的骨髓間充質干細胞在涂有GO(0.1mg/mL)的培養皿中能夠增殖[17]。Yang等[18]在昆明鼠體內分別靜脈注射1mg/kg和10mg/kg的單層石墨烯，觀察14天后石墨烯低濃度組鼠體內未出現明顯的炎癥反應，但在高濃度組中，鼠肺部出現明顯的炎癥反應、肺部水腫和肉芽病變等。也有研究表明，哺乳類動物的細胞在接觸到石墨烯后活性略有下降，這是由于細胞被誘導氧化應激和細胞凋亡而造成的[14]。石墨烯最親水的形式就是能夠穿透細胞膜，而相比疏水的形式來說累積在細胞膜表面的毒性就更小了。

3.石墨烯在生物醫學中的應用研究

3.1 抗菌的應用 石墨烯可以防止病原菌和腐蝕性微生物的形成，甚至能殺死細菌，使其可能成為外科設備或其他表面的抗微生物涂層材料[19]。細菌接觸到石墨烯材料后使其自身活力下降[20]，是細菌膜與石墨烯片的尖銳邊緣直接接觸造成的機械損傷，也可能涉及到氧化應激效應[21]。2010年,Hu等[22]首次報道了石墨烯具有優異的抗菌性,研究發現氧化石墨烯納米懸液與大腸桿菌共培養2h后,對大腸桿菌的抑制率超過90%。

對基于石墨烯復合材料如含石墨烯的殼聚糖聚乙烯醇納米纖維支架進行了傷口愈合潛力試驗的探索[23]。相比其他組，含有石墨烯組能夠加速傷口愈合，認為這是石墨烯的自由電子抑制細胞分裂和防止微生物繁殖的結果。隨后的抗菌實驗是用農桿菌、大腸桿菌和酵母菌以證實石墨烯可抑制原核細胞(農桿菌和大腸桿菌)的生長，而真核細胞(酵母菌)不受抑制。這對于真核細胞包括人成纖維細胞[24]來說，石墨烯具有抗菌活性且無明顯的細胞毒性，表明含有石墨烯的復合材料可用于臨床應用。2012年，美國科學家研究出一種能探測人體體內病菌的牙齒芯片，這是由石墨烯材料制作的平面電子芯片傳感器，將其安裝在牙齒表面，可在病人一呼一吸間搜集口腔內的細菌信息，通過內置的無線網絡將信息傳送至計算機中，醫務人員可分析細菌是否有進一步感染和擴散的可能。

3.2 藥物和基因傳遞 近些年石墨烯及成員(包括GO和rGO)因其生物相容性被應用于生物醫學[25]。石墨烯良好的藥物承載能力促使大量研究者在不同類型的癌癥中探索其性能。根據總體趨勢，研究最多的腫瘤是乳腺癌，占總數的31%[26]，其次是宮頸癌[27]和肝癌[28]，分別占23%和10%。其它癌癥的類型如皮膚癌[29]，神經膠質瘤[30]等通過不同的藥物與石墨烯或GO共軛治療已有研究。

3.2.1 藥物遞送 諸多研究使用聚乙二醇(PEG)以增加石墨烯或GO的生物相容性和穩定性并通過π-π堆積和疏水性交互作用負載抗癌藥物[25]。Liu等[31]用不同的配體如針對大腦腫瘤的轉鐵蛋白和阿霉素(DOX)使GO-PEG的表面官能化。與轉鐵蛋白和DOX共軛的納米材料顯示出更高的細胞內傳遞效率，并對腦膠質瘤具有更強的毒性。

Zhang等[26]提出了一個非常創新的方式，利用官能化的GO用于生物醫學研究中。作者首先利用磺酸使GO功能化，后將葉酸共軛連接至GO中，同時負載阿霉素(DOX)和喜樹堿(CPT)兩種抗癌藥物，形成FA/GO/DOX/CPT復合物特異性靶向乳腺癌MCF-7細胞。實驗結果表明，負載有DOX和CPT的石墨烯復合物對MCF-7細胞的靶向性更強，抗腫瘤性更高。

3.2.2 基因遞送 石墨烯復合物作為智能基因(siRNA、dsRNA和聚核苷酸)的載體也廣泛應用于基因相關疾病的治療[27]。例如，Zhi等成功地使用GO共遞送藥物(阿霉素)與siRNA抗miRNA-21(抗-miR-21)作用于乳腺癌細胞。研究發現，將GO作為化療藥物和siRNA的載體有利于腫瘤治療[32]。Yin等進行另一項研究，專注于黑色素瘤[29]，這是一種病因較復雜的嚴重性疾病，通過免疫治療和靶向治療有廣闊的前景[33]。在此背景下，作者證明了用GO作為Stat3 siRNA的載體，研究結果表明在小鼠體內治療后無毒性，且腫瘤的生長和腫瘤的重量顯著消退[29]。

3.3 在神經科學領域的應用 目前，對腦功能的研究技術主要依靠神經元信號電子監控和模擬。光學成像和電生理記錄是闡明在神經系統疾病中個人的神經回路如何運作的關鍵，電子技術和光學技術相互區別同時優勢互補。迄今為止，不論是高分辨率光學圖像還是電生理數據只能分別獲得，因為傳統的不透明的金屬微電極會阻礙觀察者的視野并產生暗影。然而，一個透明的柔性的石墨烯電極能夠同時光學成像和電生理記錄[34]。

透析腦部的解剖結構與功能一直是神經科學領域所追求的目標，程國勝團隊的研究結果發現，二維石墨烯薄膜與海馬神經元細胞之間有良好的生物相容性，且二維石墨烯能顯著促進神經突起的發生和生長。后期的研究表明，三維石墨烯支架不僅對神經干細胞的增殖起到促進作用，還且很大程度上可誘導神經干細胞定向分化為功能神經元。

石墨烯還具有優良的生物相容性且顯著地促進小鼠海馬細胞的軸突發育和生長[35]。與在聚苯乙烯材料上相比，在石墨烯片上接種細胞后軸突的數量和軸突的平均長度顯著增強。

3.4 石墨烯在骨組織工程中的應用 在骨組織工程中，支架材料尤為重要，它不但為特定的細胞提供支撐結構，而且還可引導組織再生。由于頜骨腫瘤切除、感染、牙周炎等造成的骨缺損在臨床較為常見，但是骨重建是一項重大的挑戰，這是一個全球性的健康問題。基于干細胞的治療有望成為最佳的解決方案，但是它需要生物相容性優良并能夠促進細胞粘附、遷移和分化的材料作為載體。

例如，由于羥基磷灰石(HA)與骨骼內的無機成分相似，故磷酸鈣陶瓷通常用于骨修復或骨再生[36]。在HA中加入GO可以提高涂層的粘著強度，并且GO/HA復合物涂層比單純HA涂層更具有耐腐蝕能力[37]。將石墨納米片(GNP)加入至45S5生物玻璃中可形成一種具有高導電性的復合物，這種導電生物材料可在骨組織工程中磷酸鈣陶瓷應用，能促進成體干細胞生長并且通過電生理信號的傳遞使組織再生[38]。

殼聚糖水凝膠可作為支架材料用于修復骨及軟骨，但是機械強度和彈性較差。若在水凝膠中加入GO，形成GO/殼聚糖/β-甘油磷酸鈉復合溫敏凝膠具有更好的理化性質和生物學特性[39]。石墨烯的濃度決定這種復合物材料的應力強度和彈性強度。Wang等[40]研究發現氟化的石墨烯不僅可增強MSCs的粘附和增殖能力，還可在很大程度上促進MSCs的生長。

已研究石墨烯和GO對誘導多能干細胞(iPS細胞)的增殖和分化，為再生醫學的細胞來源帶來了希望[41]。與在玻璃表面相比，培養在GO表面上的iPS細胞以更快的速度粘附和增殖，此外，石墨烯很好地維持了iPS細胞未分化的狀態，通過GO使其加速分化。在人間充質干細胞(hMSCs)和預成骨細胞上研究了石墨烯和GO的分化潛能[42]。與其它表面包括玻璃相比，石墨烯和GO能夠促進hMSCs的粘附、增殖和分化。

4.總結與展望

石墨烯是納米生物技術中迅速崛起的新興材料。盡管它的歷史較短，但它優良的理化性能和生物學特性備受研究者關注。到目前為止石墨烯應用于多種生物醫學，包括神經科學、藥物和基因載體、抗菌材料、組織工程支架等。

改性的石墨烯與支架材料有良好的生物相容性，可誘導細胞粘附和增殖，并促進干細胞向成骨細胞系分化。此外，它能夠很容易地官能化以結合生物分子誘導和調控干細胞的行為。雖然還存在一些挑戰，但利用石墨烯誘導成骨分化的進一步研究成果值得期待。這些挑戰之一是我們并未更加全面而深刻的了解石墨烯刺激干細胞的分化機制與信號通路等。此外，一定不可忽視石墨烯在活體試驗中的效果，還需要在動物體內做深入的研究以評估材料對組織及器官的相互作用機制，允許未來的臨床應用。

由于獨特的結構和優異的性能，石墨烯及其衍生物對于生物醫學應用有著巨大的潛力，但是，石墨烯生物技術領域正處于起步階段，還有更多的性能有待發現，為將來在不同研究領域的重大應用提供廣闊的空間。

[1] Bae H,Chu H,Edalat F,et al.Development of functional biomaterials with micro-and nanoscale technologies for tissue engineering and drug delivery applications[J].J Tissue Eng Regen Med,2014,8(1):1-14

[2] Rosa V,Della Bona A,Cavalvanti BN,et al.Tissue engineering:from research to dental clinics[J].Dent Mater,2012,28(4):341-348

[3] Rosa V,Zhang Z,Grande RH,et al.Dental pulp tissue engineering in full-length human root canals[J].J Dent Res,2013,92(11):970-975

[4] Lee C,Wei X,Kysar JW,et al.Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayer graphene[J].Science,2008,321(5887):385-388

[5] Kostarelos K,Novoselov KS.Materials science.Exploring the interface of graphene and biology[J].Science,2014,344(6181):261-263

[6] Goenka S,Sant V,Sant S.Graphene-based nanomaterials for drug delivery and tissue engineering[J].J Control Release,2014,173:75-88

[7] Liu J,Cui L,Losic D.Graphene and graphene oxide as new nanocarriers for drug delivery applications[J].Acta Biomater,2013,9(12):9243-9257

[8] Depan D,Misra RD.The interplay between nanostructured carbon-grafted chitosan scaffolds and protein adsorption on the cellular response of osteoblasts:structure-function property relationship[J].Acta Biomater,2013,9(4):6084-6094

[9] Wells DB,Belkin M,Comer J,et al.Assessing graphene nanopores for sequencing DNA[J].Nano Lett,2012,12(8):4117-4123

[10]Zhang M,Yin BC,Tan W,et al.A versatile graphenebased fluorescence"on/off"switch for multiplex detection of various targets[J].Biosens Bioelectron,2011,26(7):3260-3265

[11]Alzahrani AZ,Srivastava GP.Gradual changes in electronic properties from graphene to graphite:first-principles calculations[J].J Phys Condens Matter,2009,21(49):495503

[12]Bunch JS,Verbridge SS,Alden JS,et al.Impermeable atomic membranes from graphene sheets[J].Nano Lett,2008,8(8):2458-2462

[13]Nair RR,Blake P,Grigorenko AN,et al.Fine structure constant defines visual transparency of graphene[J].Science,2008,320(5881):1308

[14]Pinto AM,Goncalves IC,Goncalves FD.Magalhaes,Graphene-based materialsbiocompatibility:a review[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2013,111:188-202

[15]Novoselov KS,Geim AK,Morozov SV,et al.Electric field effect in atomically thin carbon films[J].Science,2004,306(5696):666-669

[16]Kim SM,Kim JH,Kim KS,et al.Synthesis of CVD-graphene on rapidly heated copper foils[J].Nanoscale,2014,6(9):4728-4734

[17]Elkhenany H,Amelse L,Lafont A,et al.Graphene supports in vitro proliferation and osteogenic differentiation of goat adult mesenchymal stem cells:potential for bone tissue engineering[J].J Appl Toxicol,2015,35(4):367-374

[18]Yang K,Wan J,Zhang S,et al.In Vivo Pharmacokinetics，Long-Term Biodistribution,and Toxicology of PE Gylated Graphene in Mice[J].ACS Nano,2011,5(1):516-522

[19]Santos CM,Mangadlao J,Ahmed F,et al.Graphene nanocomposite for biomedical applications:fabrication,antimicrobial and cytotoxic investigations[J].Nanotechnology,2012,23(39):395101

[20]Liu S,Zeng TH,Hofmann M,et al.Antibacterial activity of graphite,graphite oxide,graphene oxide,and reduced graphene oxide:membrane and oxidative stress[J].ACS Nano,2011,5(9):6971-6980

[21]Gurunathan S,Han JW,Dayem AA,et al.Oxidative stressmediated antibacterial activity of graphene oxide and reduced graphene oxide in Pseudomonas aeruginosa[J].Int J Nanomedicine,2012,7:5901-5914

[22]Hu WB,Peng C,Luo W,et al.Graphene-based antibacterial paper[J].ACS Nano,2010,4(7):4317-4323

[23]Lu B,Li T,Zhao H,et al.Graphene-based composite materials beneficial to wound healing[J].Nanoscale,2012,4(9):2978-2982

[24]Mejias Carpio IE,Santos CM,Wei X,et al.Toxicity of a polymer-graphene oxide composite against bacterial planktonic cells,biofilms,and mammalian cells[J].Nanoscale,2012,4(15):4746-4756

[25]Sahoo NG,Bao H,Pan Y,et al.Functionalized carbon nanomaterials as nanocarriers for loading and delivery of a poorly water-soluble anticancer drug:a comparative study[J].Chem Commun(Camb),2011,47(18):5235-5237

[26]Zhang L,Xia J,Zhao Q,et al.Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs[J].Small,2010,6(4):537-544

[27]Kim H,Namgung R,Singha K,et al.Graphene oxidepolyethylenimine nanoconstruct as a gene delivery vector and bioimaging tool[J].Bioconjug Chem,2011,22(12):2558-2567

[28]Wei G,Yan M,Dong R,et al.Covalent modification of reduced graphene oxide by means of diazonium chemistry and use as a drug-delivery system[J].Chemistry,2012,18(46):14708-14716

[29]Yin D,Li Y,Lin H,et al.Functional graphene oxide as a plasmid-based Stat3 siRNA carrier inhibits mouse malignant melanoma growth in vivo[J].Nanotechnology,2013,24(10):105102

[30]Wang Y,Huang R,Liang G,et al.MRI-visualized,dualtargeting,combined tumor therapy using magneticgraphenebased mesoporous silica[J].Small,2014,10(1):109-116

[31]Liu G,Shen H,Mao J,et al.Transferrin modified graphene oxide for glioma-targeted drug delivery:in vitro and in vivo evaluations[J].ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(15):6909-6914

[32]Zhi F,Dong H,Jia X,et al.Functionalized graphene oxide mediated adriamycin delivery and miR-21 gene silencing to overcome tumor multidrug resistance in vitro[J].PLoS One,2013,8(3):e60034

[33]Tomei S,Wang E,Delogu LG,et al.Non-BRAF-targeted therapy,immunotherapy,and combination therapy for melanoma[J].Expert Opin Biol Ther,2014,14(5):663-686

[34]Kuzum D,Takano H,Shim E,et al.Transparent and flexible low noise graphene electrodes for simultaneous electrophysiology and neuroimaging[J].Nat Commun,2014,5:5259

[35]Li N,Zhang X,Song Q,et al.The promotion of neurite sprouting and outgrowth of mouse hippocampal cells in culture by graphene substrates[J].Biomaterials,2011,32(35):9374-9382

[36]Depan D,Girase B,Shah JS,et al.Structure-process-property relationship of the polar graphene oxide-mediated cellular response and stimulated growth of osteoblasts on hybrid chitosan network structure nanocomposite scaffolds[J].Acta Biomater,2011,7(9):3432-3445

[37]Tian Q,Liu H.Electrophoretic deposition and characterization of nanocomposites and nanoparticles on magnesium substrates[J].Nanotechnology,2015,26(17):175102

[38]Porwal H,Grasso S,Cordero-Arias L,et al.Processing and bioactivity of 45S5 Bioglass((R))-graphene nanoplatelets composites[J].J Mater Sci Mater Med,2014,25(6):1403-1413

[39]秦 漢,王 劍,楊 濤,等.石墨烯/殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溫敏凝膠的制備及其性能評價[J].口腔頜面修復學雜志,2016,17(5):257-262

[40]Wang Y,Lee WC,Manga KK，et al.Fluorinated graphene for promoting neuro-induction of stem cells[J].Adv Materials,2012,24(31):4285-4290

[41]Chen GY,Pang DW,Hwang SM,et al.A graphene-based platform for induced pluripotent stem cells culture and differentiation[J].Biomaterials,2012,33(2):418-427

[42]Nayak TR,Andersen H,Makam VS,et al.Graphene for controlled and accelerated osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].ACS Nano,2011,5(6):4670-4678