小潮氣量高頻機械通氣對糖尿病模型小鼠肺損傷和炎癥因子的影響

錢家樹 林學正 盧光濤

小潮氣量高頻機械通氣對糖尿病模型小鼠肺損傷和炎癥因子的影響

錢家樹 林學正 盧光濤

目的 觀察小潮氣量高頻機械通氣對糖尿病模型小鼠肺損傷和炎癥因子的影響。方法成年雄性C57BL/6N小鼠40只，采用隨機數字表法分為糖尿病+機械通氣組（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸組（Dia-SB）、正常對照+機械通氣組（Con-MV）和正常對照+自主呼吸組（Con-SB組），各10只。檢測各組小鼠血漿腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織勻漿TNF-α、IL-6和IL-10表達量。改良組織學評分系統評估肺損傷程度。結果 與治療前相比，Dia-MV組血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平隨通氣持續時間逐漸增加，而Con-SB組無顯著變化。肺勻漿上述促炎細胞因子定量RT-PCR分析與血漿結果類似。Dia-MV組血漿SOD活性隨著機械通氣進行降低，MDA水平增加。肺勻漿SOD/MDA定量RT-PCR分析與血漿結果類似。與Con-SB組[（0.64±0.05）分]相比，Dia-MV組[（3.83±0.34）分，P＜0.05）]、Dia-SB組[（2.11±0.20）分，P＜0.05]、Con-MV[（1.98±0.18）分，P＜0.05]肺損傷評分增加。結論 小潮氣量高頻機械通氣增加糖尿病模型小鼠肺損傷。

小鼠；糖尿??；機械通氣；小潮氣量；肺損傷；TNF-α；IL-6；IL-10

機械通氣（mechanical ventilation，MV）是用于全身麻醉的必要的呼吸支持方法。不適當的通氣，特別是高潮氣量通氣可導致肺損傷，其特征在于增加肺血管通透性和促使炎性介質的產生[1]。與傳統的通氣方法相比，小潮氣量通氣策略具有低潮氣量和平臺壓力，能夠降低機械通氣過程中肺損傷發生幾率[2]。近年來，越來越多的證據表明糖尿病與肺損傷密切相關[3-5]，在慢性高血糖狀態下，細胞外基質沉積和肺纖維化，導致肺泡氣體與血液交換障礙。糖尿病對小潮氣量機械通氣策略下肺功能的影響尚不清楚。本研究通過建立糖尿病動物模型，運用小潮氣量高頻率通氣策略，檢測炎癥細胞因子腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）的表達和血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平，探討小潮氣量高頻機械通氣對糖尿病模型小鼠肺損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年雄性C57BL/6N小鼠（50～60g）40只，來自溫州醫科大學動物實驗中心，實驗動物合格證號：SCXK-20120031。采用隨機數字表法分為四組：糖尿病+機械通氣組（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸組（Dia-SB）、正常對照+機械通氣組（Con-MV）、正常對照+自主呼吸組（Con-SB組），各10只。本實驗研究經溫州醫科大學附屬第一醫院動物倫理委員會批準。

1.2 糖尿病動物模型制作 C57BL/6N小鼠適應性飼養2天，糖尿病+機械通氣組（Dia-MV）、糖尿病+自主呼吸組（Dia-SB）予脂類誘導飼料喂養4周后，予鏈脲佐菌素（STZ）溶于檸檬酸緩沖液（pH4.3，0.1mol/L）30mg/kg一次性腹腔注射，繼續普通飼料喂養2周后禁食8h，按2g/kg灌服20%葡萄糖溶液，做口服糖耐量試驗，0min和120min血糖分別＞7.0mmol/L和11.0mmol/L為造模成功[6]。

1.3 機械通氣 使用動物呼吸機對Dia-MV和Con-MV組小鼠進行4h高頻低潮氣量機械通氣，參數設置如下：潮氣量8mL/kg，呼吸頻率150次/分鐘，吸氣氧分數0.35。同時，將Dia-SB和Con-SB兩組小鼠暴露于室內空氣中自主呼吸4h。在實驗過程中，使用多通道生理記錄儀連續監測氧飽和度、血壓和心率，并且輸注林格氏溶液（8～10mL/h）以補充液體損失并將血壓保持在正常范圍內。實驗開始后每小時從左頸動脈獲得血液樣品以分析血清參數，實驗結束斷頭處死小鼠，取肺組織標本備用。

1.4 觀察指標及方法 （1）采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平，比色法檢測超氧化物歧化酶（SOD）/丙二醛（MDA）水平。（2）RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織 TNF-α、IL-6和IL-10相對表達量。實驗后取左肺組織100mg勻漿，采用Trizol試劑盒（上海生物工程技術有限公司）抽提總RNA，逆轉錄反應合成cDNA，然后采用PCR儀進行擴增，內參基因為GAPDH。目標基因是與內參GAPDH基因檢測的引物（Invitrogen公司提供），序列為：Primer 1（Forward，5′→3′）；Primer 2（Reverse，5′→3′）GAPDH TGAAGGTCGGTGTGAAC GGATTTG GTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGTC；IL-6 GCACCCACTTCAAGCTCCA AAATTTGAAGGTGAGCATCCTG；IL-10 TGCCTTCAGCCAGGTGAAACTTT C CTTGATTTCTGGGCCATGCTTCTCTG；TNF-α AT ACCAACTATTGCTTCAGCTCCACAG GTACTGTGTG TCCAGGCTCCAAATAT；IL-1β GCACAGTATTGAAA GCCTAGAAAGTCGGTAGAAAGAGATAATCTGCTC TG。（3）肺組織病理學評估：中性粒細胞計數（PMN）、濕/干重比（W/D）和肺損傷評分。實驗結束后取左肺部分肺葉，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，嵌入石蠟包埋，連續切片厚約4μm。HE染色，在光鏡下觀察肺組織病理學變化。肺損傷程度采用改良組織學評分系統[11]進行評估：①肺泡壁厚度；②炎性細胞浸潤、聚集；③出血。每一項按以下五點進行分級：0為最小傷害，1為輕度損傷，2為中度損傷，3為重度損傷，4為最大損傷。肺損傷程度0～12分。中性粒細胞計數用來評估中性粒細胞浸潤的程度，隨機選擇十個區域，計算每高倍視野肺泡（HPF，400×）的中性粒細胞數，取平均值。取右肺上葉樣品進行稱重，然后置60℃烤箱中，24h后再次稱重，計算濕/干重比。

1.5 統計學方法 應用SPSS12.0軟件包進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間總體比較采用雙因素方差分析，組間各時間點參數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿和肺組織勻漿炎癥因子比較 機械通氣前，Dia-MV組和Dia-SB組血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平高于Con-MV組和Con-SB組，機械通氣后，Dia-MV組上述指標高于其它三組（P＜0.05）。與治療前相比，Dia-MV組血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平隨著通氣持續時間逐漸增加，而Con-SB組無明顯變化（圖1A～C，插頁）。肺勻漿中上述促炎細胞因子的定量RT-PCR分析顯示與血漿結果類似（P＜0.05）（圖2，插頁）。

2.2 血漿和肺組織勻漿氧化應激參數比較 機械通氣前，Dia-MV和Dia-SB組血漿 SOD活性低于Con-MV組和Con-SB組，而MDA水平則呈反向趨勢。Dia-MV組血漿SOD活性隨著機械通氣進行降低，MDA 水平則增加（圖 1D～E，插頁）。Con-SB 組中未發現MDA水平和SOD活性的顯著變化。肺勻漿SOD/MDA定量RT-PCR分析顯示與血漿結果類似（P＜0.05）（圖 2，插頁）。

2.3 肺組織病理學改變及肺損傷評分 與Con-SB組[（0.64±0.05）分]相比，Dia-MV組[（3.83±0.34）分，P＜0.05]、Dia-SB組[（2.11±0.20）分，P＜0.05]、Con-MV[（1.98±0.18）分，P＜0.05]肺損傷評分增加（圖3，插頁）。Dia-MV組中的肺組織可見間質水腫，炎性細胞浸潤，肺泡破裂出血，而在Dia-SB組或Con-MV組中僅發現輕微的肺微觀結構變化。

3 討論

本研究發現，糖尿病增加低潮氣量高頻通氣小鼠肺損傷，可能與炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10增加和機體氧化應激平衡被打破有關。低潮氣量（6mL/kg）和低平臺壓力保護性機械通氣策略被證明可減少急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者肺損傷，降低死亡率[7-8]。本研究對象為小鼠，為了避免通氣不足使用潮氣量8mL/kg和頻率150次/min行機械通氣。

有證據表明DM與肺損傷密切相關，研究[9-11]認為，在慢性高血糖狀態下，細胞外基質沉積和肺纖維化是糖尿病肺損傷病變的早期病理特征，但導致DM患者肺功能下降的主要原因是肺泡氣體與血液交換障礙[12]。

本研究發現，隨著機械通氣時間增加，血漿炎性細胞因子和MDA顯著增加，SOD水平降低，肺組織勻漿定量RT-PCR分析顯示類似的結果。糖尿病小鼠機械通氣4h后肺部可見間質水腫，炎性細胞浸潤，肺泡破裂或出血，肺損傷評分顯著高于其他組（P＜0.05），而非糖尿病小鼠對機械通氣耐受性較好。這一結果與 Zarogoulidis 等[13]、Klein 等[14]和 Mirrakhimov[15]學者的調查結果相同，上述研究經過大樣本的追蹤調查發現，長期高血糖患者肺功能下降與炎癥因子釋放呈現中等強度的相關。另外的橫向比較研究還發現，循環血液中血糖水平、炎癥因子與未來發生肺功能下降的風險呈正相關[16]。

在糖尿病小鼠機械通氣肺損傷發病過程中，除了上述高血糖引起的肺組織微結構性病變外，氧化應激平衡被打破也是重要原因之一[17]。在本研究中，隨著機械通氣時間延長，反應脂質過氧化的指標MDA水平增加，而抗氧化指標SOD則減少，可見糖尿病小鼠體內氧化應激平衡更容易被機械通氣破壞。氧自由基是脂質過氧化的產物，與肺毛細管基底膜結合，從而損害肺毛細血管屏障通透性。在糖尿病影響下，除了葡萄糖可以自然氧化生成氧自由基外，NOS、NAD（P）H氧化酶和黃嘌呤氧化酶等多種活性物質也會導致氧自由基增加[18-20]。此外，線粒體呼吸鏈已被視為非酶生成氧自由基的另一個來源。糖尿病抑制了內源性抗氧化酶，包括谷胱甘肽、SOD、過氧化氫酶，從而影響活性氧的激活。

總之，低潮氣量和高頻保護性機械通氣策略，仍能增加糖尿病模型小鼠炎癥反應和相關肺損傷，其機制還有待于進一步研究。

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第五次世界中西醫結合大會第三輪會議征文通知

世界中西醫結合大會，每五年召開一次，已成功舉辦4次。第五次世界中西醫結合大會將于2017年12月7日—10日在廣州白云國際會議中心召開。本次大會的主題是“弘揚結合醫學成果，服務人類健康”。大會由中國中西醫結合學會主辦，廣東省中西醫結合學會、廣東藥科大學承辦，會議將全面展示近五年世界結合醫學（包括中西醫結合）的最新成果和研究進展，并邀請國內外著名專家學者進行精彩報告，通過相互交流和共同提高，促進醫學創新?，F將征文相關事宜通知如下：

1、征文內容（1）中西醫結合理論研究，包括對結合醫學學術地位與作用的認識，對新形勢下發展結合醫學的思路、途徑和方法的理論探討與經驗總結等；（2）近五年來結合醫學在臨床研究、基礎研究、藥學研究、教學研究、學科建設、政策研究等方面取得的重要成果和寶貴經驗；（3）結合醫學各臨床專業學科新診療經驗的總結和分析，中西醫結合新技術、新方法的推介與評價，以及實現科研成果向臨床應用轉化的新經驗與新模式；（4）中西醫結合優勢病種臨床診療路徑的實踐經驗與臨床共性問題的探討，中西醫結合標準化研究等；（5）結合醫學的未來研究，以及其他促進結合醫學發展的相關研究等。

2、征文要求（1）向本次大會所提交的論文應為未正式發表的論文。論文要求突出科學性、先進性、實用性、原創性，論據充分，對專業實踐和行業管理具有一定的指導意義；（2）論文需提交中、英文摘要（800～1000字），欲了解更詳細的論文格式要求，請登錄世界中西醫結合大會網站www.wimco2017.com；（3）投稿前請在投稿網站詳細填寫“新用戶注冊信息”，務必注明作者所屬專業委員會（專業）、工作單位、職務職稱、通訊地址、電子郵箱和手機號碼等信息。

3、聯系方式地址：北京市東直門內南小街16號 郵編：100700 電話：010-64093165 010-64025672 聯系人：孔令青李亮平 趙蓬悅 010-59001126 13810810901

中國中西醫結合學會

2017年7月19日

The ProtectiveMechanical Ventilation Strategy Based on Low Tidal Volumes and High FrequencyIncreases Lung Injury in Diabetes Mice

QIAN Jiashu,LIN Xuezheng,LU Guangtao.

Department of Anesthesiology,Taizhou Central Hospital(TaiZhou University Hospital),Taizhou(318000),China

ObjectiveTo investigate the effects of protective mechanical ventilation（MV） strategyon inflammation and lung injury in mice withdiabetes.MethodsForty C57BL/6N mice were randomly divided two groups:diabetic model was established in 20 mice and then subdivided into MVgroup（Dia+MV group）and spontaneous respiratory（SB） group（Dia+SB group）,with 10 mice in each;another 20 normal mice served as controls,which were also subdivided into Con+MV group and Con-SB group,with 10mice in each.Tumor necrosis factor-α（TNF-α）,interleukin-6（IL-6）,interleukin-10（IL-10）,superoxide dismutase（SOD） and malondialdehyde（MDA） levels in serum were detected and the expression of inflammatory cytokine mRNA was also determined in lung tissue.Lung damage was assessed using a modified lung injury score.ResultsCompared to baseline values,the serum levels of TNF-α,IL-6 and IL-10 were gradually increased over ventilation duration in Dia-MV group,while no similar results were observed in con-SB group.The activities of serum SOD decreased and MDA levels were conversely increased along with ventilation duration in Dia-MV group.Quantitative RT-PCR analysis of pro-inflammatory cytokines in lung homogenates presented similar results.The modified lung injury score was higher in Dia-MV group,Dia-SB group and Con-MV group as compared to that in Con-SB group（3.83±0.34,2.11±0.20,2.11±0.20 vs 0.64±0.05,P＜0.05）.ConclusionThe protectivemechanical ventilation strategy based on low tidal volumes and high frequency increased the inflammation reaction and associated lung injury in diabetic mice.

mice;diabetes;mechanical ventilation;low tidal volume;lung injury;TNF-α;IL-6;IL-10

浙江省臺州市中心醫院（臺州學院附屬醫院）麻醉科（臺州318000）

錢家樹，Email：2793913132@qq.com；Tel：13906631675

（收稿：2017-04-20 修回：2017-06-10）