EDTA依賴的假性白細(xì)胞減少的實(shí)驗(yàn)分析與糾正對策

陳龍 徐旭棟 張永為 陸新建 肖湘陽 王劍超?

EDTA依賴的假性白細(xì)胞減少的實(shí)驗(yàn)分析與糾正對策

陳龍 徐旭棟 張永為 陸新建 肖湘陽 王劍超?

目的 研究EDTA依賴的白細(xì)胞聚集對血液分析儀檢測結(jié)果的影響，探討抗凝劑介導(dǎo)的白細(xì)胞聚集的可能機(jī)制和白細(xì)胞計(jì)數(shù)糾正方法。方法 統(tǒng)計(jì)與分析2014年10月至2016年10月345600例門診、住院血常規(guī)標(biāo)本發(fā)生EDTA誘導(dǎo)的白細(xì)胞聚集導(dǎo)致假性白細(xì)胞減少例數(shù)的相關(guān)情況。結(jié)果 共發(fā)生EDTA依賴的白細(xì)胞聚集7例，其它原因?qū)е掳准?xì)胞聚集27例，發(fā)生率分別為0.002%和0.008%。由于白細(xì)胞聚集導(dǎo)致儀器自動(dòng)白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果假性偏低，與人工顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明EDTA誘導(dǎo)的白細(xì)胞聚集在37℃水浴30min和更換枸櫞酸鈉抗凝劑后白細(xì)胞聚集情況未得到糾正，相較于白細(xì)胞人工鏡檢計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而標(biāo)本采用儀器稀釋液與標(biāo)本血漿等量置換以及標(biāo)本中加入卡那霉素20mg/ml方法后，標(biāo)本中白細(xì)胞聚集現(xiàn)象得到部分糾正，但儀器結(jié)果與人工鏡檢計(jì)數(shù)差異仍存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 EDTA抗凝劑誘導(dǎo)的假性白細(xì)胞減少發(fā)生率為 0.002%，極易漏診。發(fā)現(xiàn)有白細(xì)胞聚集的情況應(yīng)采用人工顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)行檢測結(jié)果糾正，以防發(fā)生誤診誤治。

假性白細(xì)胞減少 EDTA 白細(xì)胞聚集

在日常的臨床檢驗(yàn)工作中，全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀因其快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，標(biāo)本靜脈抗凝血，抗凝劑為乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2），因其對紅白細(xì)胞影響較小，并可抑制血小板在體外聚集等優(yōu)點(diǎn)已被國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)作為認(rèn)定的血液抗凝劑而廣泛使用。盡管如此，關(guān)于EDTA-K2抗凝血可引起血小板聚集導(dǎo)致假性血小板減少（PTCP）現(xiàn)象已被大家普遍認(rèn)知［1］，然而關(guān)于EDTA誘導(dǎo)的假性白細(xì)胞減少現(xiàn)象卻少有報(bào)道，這種現(xiàn)象容易導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)誤發(fā)生，導(dǎo)致臨床上假性白細(xì)胞減少［2］。因此，作為從事檢驗(yàn)工作者，應(yīng)該對這類現(xiàn)象給予高度重視，為了得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，必須留心觀察并排除干擾細(xì)胞分析的因素，不可完全依賴儀器的檢測結(jié)果。現(xiàn)將本科室在過去兩年中遇到的7例EDTA抗凝劑誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集導(dǎo)致的白細(xì)胞減少現(xiàn)象進(jìn)行分析研究，以期為檢驗(yàn)人員在日常工作中遇到此類現(xiàn)象進(jìn)行糾正提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集本院2014年10月至2016年10月間門診和住院患者外周血液樣本 345600例，通過人工顯微鏡觀察和血涂片瑞士染色鏡檢證實(shí)得到符合白細(xì)胞假性減少病例34例，然后采用37℃水浴等方法證實(shí)34例假性白細(xì)胞減少標(biāo)本中與溫度相關(guān)因冷凝集素等誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集而導(dǎo)致的假性白細(xì)胞減少27例，其余7例無論是采用37℃水浴還是更換抗凝劑均不能糾正儀器白細(xì)胞假性減少現(xiàn)象，但該7例患者通過采末梢血（未加EDTA抗凝劑）進(jìn)行儀器白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）與人工顯微鏡WBC結(jié)果未見明顯差異。對此7例病例標(biāo)本進(jìn)行總結(jié)分析，其中男4例，女3例；年齡15～76歲，中位年齡49歲，7例患者標(biāo)本分別來自腫瘤科1例，血液科2例，心內(nèi)科1例，內(nèi)分泌科2例，呼吸科1例。

1.2 檢測儀器 血常規(guī)用Coulter LH 750血液分析儀檢測，采用原裝配套的試劑及質(zhì)控品，當(dāng)日機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)正常，質(zhì)控品在質(zhì)控范圍。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與觀察指標(biāo) 使用Coulter LH 750血液分析檢測，所有患者的儀器結(jié)果如觸及科室制定的復(fù)檢規(guī)則，均進(jìn)行相應(yīng)的人工復(fù)檢。如涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞聚集的異常標(biāo)本除顯微鏡人工WBC（采末梢指血手工計(jì)數(shù)）糾正外，進(jìn)一步采用37℃水浴30min﹑稀釋液等量血漿置換［EDTA-K2真空抗凝管抗凝的全血標(biāo)本低速（1000r/min）離心2min，用稀釋液等量置換血漿，充分混勻后在血細(xì)胞分析儀上進(jìn)行重測］﹑更換枸櫞酸鈉抗凝劑重新采集靜脈血﹑靜脈血標(biāo)本中加入卡那霉素（20mg/ml）等不同方法預(yù)處理檢測標(biāo)本，觀察其儀器WBC糾正效果。同時(shí)，觀察與分析儀器白細(xì)胞散點(diǎn)圖及VCS參數(shù)在EDTA依賴的假性白細(xì)胞減少標(biāo)本中的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 涂片鏡檢結(jié)果 34例不同原因?qū)е录傩园准?xì)胞減少病例，在油鏡下可以觀察到白細(xì)胞成團(tuán)聚集現(xiàn)象。EDTA-K2抗凝劑誘導(dǎo)的白細(xì)胞聚集鏡下僅見白細(xì)胞聚集，紅細(xì)胞散在分布，冷凝集素導(dǎo)致的聚集，可以同時(shí)看到紅細(xì)胞聚集現(xiàn)象。

2.2 兩組（冷凝集等白細(xì)胞聚集組，EDTA誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集組）不同預(yù)處理后儀器結(jié)果前后，及與手工計(jì)數(shù)結(jié)果比較 34例假性白細(xì)胞減少的白細(xì)胞聚集標(biāo)本采用37℃水浴﹑血漿置換﹑更換枸櫞酸鈉抗凝劑﹑加卡那霉素等不同方法預(yù)處理后血細(xì)胞儀檢測白細(xì)胞較之前糾正情況，發(fā)現(xiàn)37℃水浴對27例冷凝集等因素導(dǎo)致白細(xì)胞聚集標(biāo)本具有顯著改善作用，水浴前后儀器結(jié)果差異明顯（P＜0.01），并且水浴過后儀器結(jié)果與人工末梢指血顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而同樣方法下37℃水浴30min對另外7例由EDTA抗凝劑誘導(dǎo)的白細(xì)胞聚集現(xiàn)象不能起到糾正作用，水浴前后兩次儀器結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；改用枸櫞酸鈉抗凝血對34例白細(xì)胞聚集標(biāo)本基本均無改善作用；血漿置換方法對EDTA誘導(dǎo)的白細(xì)胞假性減低可以部分糾正，而對冷凝集等原因?qū)е碌幕究梢约m正（P＞0.05）；加入卡那霉素對EDTA誘導(dǎo)的假性白細(xì)胞減少有一定的糾正作用，但對冷凝集導(dǎo)致白細(xì)胞假性減少幾乎無作用。

3 討論

EDTA-K2抗凝血發(fā)生白細(xì)胞聚集是一種罕見的血液現(xiàn)象，也可以導(dǎo)致儀器的WBC自動(dòng)計(jì)數(shù)結(jié)果假性減低，國內(nèi)外現(xiàn)已有相關(guān)個(gè)例報(bào)道［3-4］，但并不為大家熟悉和重視。有研究認(rèn)為它的發(fā)生可能與惡性腫瘤﹑感染﹑肝病和自身免疫疾病等有關(guān)［5］，其機(jī)制可能與冷凝集素等異常蛋白增高有關(guān)。至于白細(xì)胞為什么會(huì)在EDTA抗凝劑中發(fā)生聚集尚不明確，可能與以下三個(gè)因素有關(guān)：（1）患者本身體質(zhì)和疾病類型致使EDTA抗凝物質(zhì)活化白細(xì)胞表面某些隱匿性表面抗原，使白細(xì)胞相互聚集。（2）EDTA- K2與血液中的鈣離子結(jié)合形成螯合物，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生變化從而導(dǎo)致白細(xì)胞變形聚集。（3）也有文獻(xiàn)報(bào)道稱致病因素﹑藥物作用﹑陽離子抗凝劑等可導(dǎo)致白細(xì)胞間負(fù)離子減少，導(dǎo)致相互排斥力減低，距離縮短從而聚集在一起。

通過本次實(shí)驗(yàn)的幾類方法對EDTA誘導(dǎo)的白細(xì)胞假性減少現(xiàn)象（排除冷凝集導(dǎo)致白細(xì)胞聚集現(xiàn)象）比較下來，臨床工作中要想得到最為準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，避免誤診誤治，遇到EDTA誘導(dǎo)的白細(xì)胞假性減少現(xiàn)象時(shí)，最好的方法還是重新對患者采用末梢指血（未抗凝）即時(shí)涂片瑞士染色人工顯微鏡鏡檢計(jì)數(shù)白細(xì)胞。

此外，在本次實(shí)驗(yàn)中作者還發(fā)現(xiàn)當(dāng)白細(xì)胞聚集時(shí)，VCS技術(shù)參數(shù)相應(yīng)發(fā)生顯著變化。散點(diǎn)圖與VCS參數(shù)能敏感地反映白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，其能敏感的檢測出包括中性粒細(xì)胞﹑單核細(xì)胞﹑淋巴細(xì)胞等白細(xì)胞各個(gè)時(shí)期體積，胞核以及胞漿顆粒不同生理狀態(tài)下的變化，在既往研究中白細(xì)胞散點(diǎn)圖及VCS參數(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性感染中心粒細(xì)胞﹑病毒感染及免疫應(yīng)答淋巴細(xì)胞以及瘧疾感染單核細(xì)胞的形態(tài)改變等研究中。當(dāng)遇到EDTA依賴的假性白細(xì)胞減少標(biāo)本時(shí)，白細(xì)胞散點(diǎn)圖中淋巴﹑單核﹑中性粒等白細(xì)胞間相互重疊，無明確分界點(diǎn)，最終導(dǎo)致儀器對WBC分類產(chǎn)生誤差，中性粒細(xì)胞被計(jì)數(shù)偏低，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比例假性增高，說明當(dāng)白細(xì)胞成團(tuán)聚集時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀無法準(zhǔn)確識(shí)別每一類細(xì)胞；VCS技術(shù)參數(shù)中的中性粒細(xì)胞平均體積（NMV）明顯增大（P＜0.01），明顯超過了正常范圍。中性粒平均激光散射（MNS）及平均高頻傳導(dǎo)（MNC）在白細(xì)胞假性減少時(shí)明顯減低（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)白細(xì)胞聚集時(shí)中性粒細(xì)胞體積分布寬度（NDW）明顯增高，因此可以考慮將NDW顯著升高，作為白細(xì)胞聚集的一項(xiàng)參考指標(biāo)。

［1］ 關(guān)向前,陳發(fā)珍．EDTA依賴性血小板聚集及其對血小板計(jì)數(shù)的影響． 臨床輸血與檢驗(yàn),2015,17(3):239-242．

［2］ Jean-Francois L,Xavier T．EDTA-dependent lymphoagglutination．Br J Haematol,2001,115(2):237．

［3］ 孫建新,王富江．中性粒細(xì)胞聚集引起白細(xì)胞計(jì)數(shù)假性減少1例．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜 志,2013,34(21):2942

［4］ Khalil SH．EDTA-dependent leukoagglutination． American Journal Of ClinicaPathology, 1991, 96 (1):147-155．

［5］ 楊大干,陸麗芬,李雪芬,等．外周血中性粒細(xì)胞低溫聚集一例．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2005,20(2):108．

Objective To study the infl uence of EDTA Dependent Leukoagglutination on the white blood cell counting result by automated blood analyzer，the possible reason of WBC aggregation caused by EDTA anticoagulant and the way to correct its infl uence. Methods Statistics and analysis，from October 2014 to October 2016，345600 cases of outpatient and inpatient blood routine specimens，EDTA induced leukocyte accumulation，leaded to the number of cases of false white blood cells. Results It revealed that the incidence was 0.002%（7 cases among 345，600）of which had EDTA induced Leukoagglutination，27 cases（0.008%）had WBC clumping caused by other reasons. These 34 samples had spuriously low WBC counts due to WBC clumping compared to manual differential results（P＜0.01）. The Leukoagglutination caused by EDTA could not be corrected by incubating samples in 37℃ water bath for 30 mints or by replacing the EDTA by sodium citrate. The leukoagglutination caused by EDTA could be partially be corrected by diluting the sample with instruments diluent at a dilution of 1：1 and by adding kanamycin 20 mg/ml to samples，but still infl uence the white blood cell counting resulted by automated blood analyzer（P＜0.001）. Conclusion EDTA can induce WBC aggregation，and thus spuriously low WBC counts，our study shows that the incidence is 0.002%. Examination of a well prepared peripheral blood smear is mandatory for every case of leukoagglutination.

Pseudo leukopenia EDTA Leukoagglutination

310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科*