長鏈非編碼RNA DANCR在關節軟骨損傷修復中作用機制的研究進展

張 聘，楊 超，趙建寧，張 雷［南京醫科大學金陵臨床醫學院（解放軍南京總醫院）骨科，南京大學醫學院臨床學院（解放軍南京總醫院）骨科，解放軍南京總醫院骨科，江蘇南京000］

·綜述·

長鏈非編碼RNA DANCR在關節軟骨損傷修復中作用機制的研究進展

張 聘1，楊 超2，趙建寧3，張 雷3［1南京醫科大學金陵臨床醫學院（解放軍南京總醫院）骨科，2南京大學醫學院臨床學院（解放軍南京總醫院）骨科，3解放軍南京總醫院骨科，江蘇南京210002］

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉錄本長度超過200個核苷酸但缺乏蛋白質編碼功能的RNA，在許多細胞生物過程中發揮重要的調控作用．關節軟骨損傷修復一直是關節外科的熱點與難點．最近研究表明lncRNA DANCR在間充質干細胞（MSCs）向軟骨細胞分化和增殖過程中發揮重要作用．lncRNA DANCR可能通過斷裂為miRNA、結合或競爭mR?NA／miRNA、增加胞質內β?catenin等途徑發揮促軟骨損傷修復作用．本文就lncRNA DANCR的結構、功能及在關節軟骨損傷修復過程中的可能作用機制作一綜述．

DANCR；miRNA；間充質干細胞；軟骨修復

0 引言

關節軟骨在膝關節傳導分布運動載荷、維持和承受接觸應力方面起著重要的生理作用．由于關節軟骨缺乏神經分布和血管供應的自身特點，一旦損傷，其自我修復往往有限［1－2］．正因為關節軟骨具有重要的生理功能和獨特的營養供應模式，關節軟骨損傷修復一直是關節外科的研究熱點．長鏈非編碼RNA（Long non?coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度大于200 nt，由基因組中非編碼序列轉錄生成的，不具有翻譯成蛋白質能力的RNA．既往被認為是基因組中的“暗物質”［3］．但近年來，大量實驗證明部分lncRNA在表觀遺傳水平、轉錄水平、翻譯水平、蛋白修飾過程中均可發揮重要的調控作用．目前已發現多種lncRNA在軟骨分化增殖中出現異常表達［4］，其中lncRNADANCR（differentiationantagonizing non?protein coding RNA）在調控間充質干細胞向軟骨分化過程發揮重要作用．

1 軟骨損傷修復的策略

臨床上根據國際軟骨修復協會（International Cartilage Repair Society，ICRS）分級法對關節軟骨損傷進行分級．學者和臨床醫師普遍認為關節軟骨損傷的修復程度與損傷類型有關，直徑1．0～2．0 mm的損傷常產生外觀與正常透明軟骨相似的修復組織；直徑3 mm以上的損傷又稱關節軟骨缺損（articular cartilage defects，ACD），大多不能完全修復，而由纖維軟骨填充；而當ACD直徑＞6 mm，其不但不能修復，還會進一步損傷周圍骨壁以及周圍關節軟骨，形成更大的缺損空洞，進而引起損傷周圍的軟骨下滑和關節軟骨的塌陷，造成膝關節骨關節炎．因此研究ACD的治療，對于阻斷膝關節損傷→ACD→骨關節炎這一疾病模式等具有重要意義．

目前主要的治療方案是減輕疼痛和控制炎癥改善功能．非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti?inflamma?tory drugs，NSAIDs）、糖皮質激素注射多年來廣泛應用，但目前的治療策略對于關節組織退行性變沒有影響［6］．不同的手術方法也已被嘗試修復受損軟骨、改善關節功能，如微骨折、軟骨下鉆孔和關節成形術．這些技術的目的是促進內在的愈合、促進血管的侵入、纖維蛋白凝塊的形成和招募干細胞［7］．然而，微骨折組織生物力學特性較差以及并發癥，細胞少與周圍軟骨損傷限制了它們的使用，此外，長期療效尚不清楚．當藥物和手術管理策略失敗，疾病進展到終末期關節炎，關節置換術可能成為唯一的和不可避免的選擇．

干細胞治療有望成為替代關節置換治療骨關節炎的突破點．間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）主要來源于骨髓、滑膜、脂肪組織、牙髓等，具有自我更新能力，并能分化為軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、心肌細胞、肝細胞、神經元．它們是骨和軟骨組織工程中的細胞來源［8－9］，其中滑膜間充質干細胞（synovial?derived MSCs，SMSCs）相比于其他來源的間充質干細胞（如骨髓、脂肪等），SMSCs的成軟骨能力和組織分化能力更強，目前已成為最理想的軟骨修復的種子細胞．成軟骨分化過程涉及復雜的途徑，包括轉錄和轉錄后水平調節，但它們在軟骨分化中的準確機制尚未明確．

2 lncRNA DANCR的結構與功能

人類基因組中只有1%～2%可以轉錄翻譯為蛋白質，約為2萬條，70%被轉錄為非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）［10］．ncRNA依據轉錄本長度分為長鏈非編碼RNA（200 nt～100 kb）和不同類型的小RNA（＜200 nt）．在過去幾年中，基因測序發現成千上萬種lncRNA，這些lncRNA盡管表達水平很低，但比編碼基因有更高的組織特異性［11］，而且參與許多細胞生物進程，包括X染色體失活，調控基因在蛋白質合成、印記，細胞周期、分化的調控，轉錄和翻譯［12－16］．lncRNA DANCR是由Kretz等［17］于2012年首先發現，它在表皮細胞中發揮去分化作用，維持表皮細胞處于未分化狀態．對lncRNA最常用的分類方法是根據他們在基因組中相對于mRNA的位置，DANCR距離最近的蛋白編碼基因是上游的USP46和下游的ERVMER34．DANCR轉錄本長度為855 bp，定位于人類4號染色體上，成熟的DANCR不包含外顯子和內含子．DANCR正義鏈引物序列為：5’?GCGCCACTATGTAGCGGGTT?3’，反義鏈引物序列為：5’?TCAATGGCTTGTGCCTGTAGTT?3’．到目前為止，只有少數RNA的結構通過化學分析測定，然而這種方法只能揭示二級結構，不能顯示三級結構［18］，因此DANCR的高級結構尚不清楚．通過細胞分級分離和亞細胞RNA?seq數據分析發現DANCR在細胞內主要定位于細胞質內，少部分定位于細胞核內［19］．DANCR已經被發現的功能主要有通過組蛋白修飾調控表皮細胞分化［5］

3 lncRNA DANCR調控關節軟骨損傷修復的機制

骨關節炎患者軟骨與正常軟骨相比，有3007條lncRNA上調和1707條lncRNA下調［24］．Wang等［4］進行人骨髓間充質干細胞軟骨分化與未分化的lncRNA芯片檢測及生物信息學分析，與未分化組相比，成軟骨分組高表達lncRNA有2166條，低表達lncRNA有1472條．最近研究發現lncRNA DANCR在關節軟骨的損傷修復中異常高表達［5］，其可能通過多種途徑調控軟骨損傷修復．

3．1 DANCR可能斷裂為某種miRNA發揮調控作用lncRNA是體內某些microRNA的前體，部分lncRNA含有包含miRNA的發夾結構，可以通過拼接或酶切等方式產生miRNA，如H19可以通過經典的Drosha?Dicer拼接方式產生miRNA?675．Huang等［25］進行BMSC向脂肪細胞分化的實驗研究發現，在BMSC分化為脂肪細胞過程中，lncRNA H19和來自于lncRNA H19的microRNA?675（miR?675）表達顯著下調．過表達H19和miR?675抑制脂肪形成，敲除他們的內源性表達可以加速BMSC向脂肪細胞分化．miR?675作用于組蛋白去乙酰化酶3’非翻譯區（HDAC）4，5，6轉錄本，導致HDACs 4，5，6放松管制，后者是脂肪細胞分化的重要分子．反過來，曲古抑菌素A（一種HDAC抑制劑）顯著降低CCCTC結合因子（CTCF）在印記控制區域的H19基因上游和隨后下調H19的表達率．這些結果表明CTCF／H19／miR?675／HDAC調控通路在骨髓間充質干細胞向脂肪細胞發揮重要作用．已經證實在干細胞成軟骨分化過程中存在著多條異常表達的miRNA，如miR?92a、miR?199a、miR?210、miR?145、miR?194等［26－28］，而在滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化過程中DANCR顯著高表達，DANCR轉錄本含有855 bp，其三級結構未知，很有可能其中某種異常表達的miRNA就來自于DANCR．

3．2 DANCR通過mRNAs／miRNA調控軟骨的分化Zhang等［5］進行的人滑膜間充質干細胞向軟骨分化的研究表明Sox4可以通過上調DANCR的表達促進SMSCs增殖和向軟骨細胞分化．DANCR啟動子包含一個Sox4結合基序（CAATGG），DANCR敲除能夠降低Sox4基因高表達誘導的MSCs增殖、分化效果，所以DANCR很可能就是Sox4的靶基因．而在軟骨分化過程中Sox基因家族與多種miRNA及mRNA存在著密切的聯系，如Sox9的調控miR?29結合靶基因Col2a1的3’UTR的過程［29］

lncRNA可以作為miRNA的競爭性內源性RNA（competing endogenous，ceRNA），調控軟骨細胞的發生、發展過程．Liu等［30］研究了lncRNAs在機械應力引起關節軟骨退變過程中的機制，發現在軟骨退變區lncRNA MSR明顯上調．MSR作為miRNA?152的競爭性內源RNA，抑制TMSB4的表達，增加基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達，參與ECM的降解，導致細胞骨架的破壞．

DANCR也有著類似MSR的作用機制．Yuan等［19］發現DANCR可以競爭性地結合CTNNB1的3’UTR來阻斷下游相關miRNA（miR?214、miR?320a和miR?199a）對CTNNB1的抑制作用．體內的這一發現表明了一種新的涉及lncRNA、mRNA和miRNA的調控機制．lncRNAs的調控機制很大程度上依賴于特定的細胞內定位，通過核漿RNA分離和rtPCR檢測發現DANCR主要存在細胞質內，而胞質內豐富的lncRNA通常參與轉錄后調控的miRNA或基因相互作用［31－32］．

3．3 DANCR能夠增加胞質內β?catenin調控軟骨的分化Wnt／β?catenin通路是MSCs向軟骨細胞增殖分化過程中的重要通路［33］．在經典的Wnt／β?catenin信號通路中，無Wnt蛋白結合時，酪氨酸激酶Iα和糖原合酶?3β使β?catenin磷酸化，再經泛素化和蛋白酶體降解，維持胞質內β?catenin處于較低水平．當Wnt通路激活時，Wnt蛋白結合Fzd和LRP5／6，通過酪蛋白激酶使散亂蛋白磷酸化，抑制糖原合酶?3β活性，使得β?catenin在胞質內穩定、聚集，轉移到細胞核內結合Tcf?Lef調控靶基因轉錄．在Zhang的實驗中，Sox4過表達引起DANCR高表達，促進SMSCs成軟骨分化，他認為可能的一種機制為Sox4通過上調β?catenin激活Wnt信號通路．而Yuan聲稱DANCR可以調節mRNA的穩定，表明DANCR對于β?catenin的作用可能是獨立于Wnt信號通路．或許DANCR能夠直接通過某種途徑維持β?catenin在胞質內的穩定．這種調控途徑可能是通過DANCR作用于糖原合酶?3β減弱其磷酸化功能；也可能DANCR直接結合于β?catenin，競爭或改變蛋白酶的結合位點，使得β?catenin不被蛋白酶識別降解．目前的研究表明DANCR能夠通過增加細胞質內β?catenin含量，從而促進β?catenin進入細胞核內發揮軟骨分化作用，具體DANCR通過何種方式增加β?catenin含量目前尚不清楚．

上述研究表明DANCR可能通過多種途徑、多種機制在促MSCs成軟骨分化與增殖過程中發揮著重要作用，具體哪種途徑最主要，哪些是最關鍵的作用位點，哪種干預方法最有希望轉化為臨床應用，這些都還有待進一步的研究．

4 展望

軟骨損傷與修復是一個復雜的調控過程，目前臨床上對于骨關節炎等原因引起的軟骨缺損尚無較好的處理方法．近年來，lncRNA在疾病的發生發展過程中的作用逐漸成為研究熱點，lncRNA DANCR被發現在促MSCs成軟骨分化與增殖過程中發揮重要作用．然而現階段對于DANCR在軟骨損傷修復中的作用機制研究非常少，尚有更多的未知機制等待研究．DANCR作為調控軟骨形成、分化的重要調控物質，有望成為臨床治療骨關節炎或軟骨損傷的一個突破點．

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Research progress on functional mechanisms of lncRNA DNACR on articular cartilage injury and repair

ZHANG Pin1，YANG Chao2，ZHAO Jiang?Ning3，ZHANG Lei3

1Department of Orthopedics，Jinling Clinical Medical College of NanjingMedicalUniversity（NanjingGeneralHospital），
2Department of Orthopedics，Clinical College of Medical School of Nanjing University（Nanjing General Hospital），3Department of Orthopedics，Nanjing General Hospital，Nanjing 210002，China

Long non?coding RNA（lncRNA）is an RNA molecule that is longer than 200 nucleotides and is not translated into a protein．LncRNAs participate in various biological processes．The repair of articular cartilage damage is always a hot and difficult point in joint surgery．Recent studies show that long non?coding RNA DANCR plays a key role in chondrogenic differentitation of human mesenchymal stem cells（MSCs）by interaction with miRNAs／mRNA and increasing the content of β?catenin in the cytoplasm．This article reviews the mechanism of DANCR in enhancing chondrogenhic differentiation and proliferation of human MSCs．

DANCR；miRNA；mesenchymal stem cells；carti?lage repair

R329．2

A

2095?6894（2017）03?62?04

2016－11－03；接受日期：2016－11－21

江蘇省博士后基金（1501168b）；中國博士后基金（2016M592956）；南京總醫院院管課題（2016003）

張 聘．碩士．研究方向：關節軟骨修復．E?mail：1430640566＠qq．com

張 雷．博士，主治醫師．E?mail：ra_eagle＠hotmail．com