蛹蟲草凝集素編碼基因JRL-ccm4的初步研究

鮑大鵬，馬元偉，2，王 榮，劉敏祥，茅文俊，汪 瀅*

（1上海市農業科學院食用菌研究所，上海 201403；2上海海洋大學食品學院，上海 201306）

蛹蟲草凝集素編碼基因JRL-ccm4的初步研究

鮑大鵬1，馬元偉1，2，王 榮1，劉敏祥1，茅文俊1，汪 瀅1*

（1上海市農業科學院食用菌研究所，上海 201403；2上海海洋大學食品學院，上海 201306）

通過對蛹蟲草基因組數據挖掘，發現Jacalin類凝集素編碼基因JRL-ccm4，進而對該基因及其編碼產物進行了生物信息學分析，通過原核異源表達獲得凝集素蛋白JRL-ccm4，并檢測了表達產物的生物學活性測定；通過RT-PCR對不同生長時期的蛹蟲草樣品中JRL-ccm4基因的表達水平進行了檢測。研究結果表明：JRL-ccm4蛋白有一個JRL結構域，能在原核細胞中成功表達；異源表達的JRL-ccm4蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌的活性，有一定抑制人宮頸癌細胞HeLa增殖的活性；原基期JRL-ccm4基因表達水平最高，是菌絲期的3.49倍，是子實體時期的2.39倍，表明JRL-ccm4基因可能參與蛹蟲草子實體形成過程。

蛹蟲草；凝集素；生物信息學分析；異源表達；基因功能

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北蟲草，屬于子囊菌門（Ascomycota）、麥角菌目（Clavicipitales）、麥角菌科（Cordyceps）。現代醫藥學研究表明，蛹蟲草具有抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、以及增強人體非特異性免疫系統的作用［1］，并對S180艾氏腹水瘤有明顯的抑制效果，同時對化療藥物環磷酰胺具有增效和降低毒性作用［2］。

凝集素是一種非免疫來源的糖結合蛋白，能使細胞凝集或糖綴合物（glycoconjugate）沉淀［3］。凝集素是食藥用真菌中重要的活性成分，大型真菌中含有種類豐富的凝集素，對其開展的研究越來越受到關注。Jacalin類凝集素（Jacalin-related lectins，JRLs）在植物中是一類能夠與內源糖類化合物結合的非經典型凝集素，研究表明，這類凝集素在植物中能夠響應生物或非生生物脅迫刺激，參與細胞調控與信號轉導，行使內源功能［4］，與經典凝集素在功能上有著明顯區別［5］。在食、藥用真菌中，Jacalin類凝集素首先在灰樹花（Grifola frondosa）中被發現，深入研究表明其最大凝集活性表現在子實體階段，在菌絲及原基中凝集活性較低［6］。但是目前對食藥菌中Jacalin類凝集素的功能還缺少深入研究。

在前期工作，本研究團隊從蛹蟲草基因組中通過數據挖掘獲得了一個編碼Jacalin類凝集素的基因，在此基礎上，本研究對該凝集素編碼基因進行了原核異源表達，構建了高效異源表達體系，檢測了異源表達的凝集素的生物活性，并測定了蛹蟲草不同生長時期該凝集素編碼基因的表達水平，為進一步深入研究和利用蛹蟲草凝集素提供了有力的科學基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 供試菌株 蛹蟲草CM-01由中科院上海植物生理生態研究所王成樹實驗室提供。

1.1.2 培養基與試劑 PDA培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

PDB培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

丙烯酰胺、N，N-亞甲叉丙烯酰胺、IPTG、SDS、考馬斯亮藍R-250、過硫酸銨、甘氨酸、Tris試劑均購自國藥集團；蛋白酶抑制劑、反轉錄及RT-PCR試劑盒、內切酶、DNA T4連接酶和高保真DNA聚合酶均購自大連寶生物工程有限公司；質粒提取試劑盒、蛋白定量檢測試劑盒、PCR產物回收試劑盒和RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；表達菌株BL21購自上海生工生物工程有限公司；引物合成和基因測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1．2 試驗方法

1.2.1 蛹蟲草JRL-ccm4基因的生物信息學分析 根據對蛹蟲草基因組測序分析，確定出甘露糖結合凝集素編碼基因JRL-ccm4（GenBank：XM-006666406）［7］，采用Protparam軟件對該基因編碼的凝集素蛋白的基本理化性質進行分析預測；采用SignalP 4.1 Server進行凝集素蛋白信號肽預測與分析；采用InterPro對凝集素蛋白保守結構域進行分析；運用NetNGlyc 1.0 Server分析凝集素蛋白糖基化位點；利用ClustalX的Muscle比對方法進行同源比對，參數為默認值；通過TMHMM Sevrver 2.0軟件對凝集素蛋白的跨膜區進行預測和分析，并采用TargetP 1.1 Sever軟件對凝集素蛋白進行亞細胞定位預測［8］。

1.2.2 蛹蟲草JRL-ccm4基因的擴增與原核表達 用25℃，150 r/min振蕩培養4 d的蛹蟲草菌絲提取RNA，以總RNA為模板反轉錄成cDNA，再以cDNA作為模板采用高保真DNA聚合酶擴增出凝集素JRL-ccm4基因，經EcoRI酶切，純化后用T4連接酶連接到經EcoRI消化的pET32a載體上，測序驗證連入方向及表達閱讀框正確后，將表達載體pET-JRL-ccm4轉化到表達菌株BL21中；挑取陽性克隆，用LB液體培養基培養過夜，菌液以1∶50擴大培養200 mL，37℃培養至OD600nm＝0.4—0.6，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，16℃誘導表達12 h。

1.2.3 重組蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4的提取 8 000 r/min、4℃離心5 min，收集誘導表達的菌體，加1 mL PBS重懸，加入5 μL蛋白酶抑制劑，用液氮速凍后進行研磨，用5 mL PBS沖洗研缽，收集沖洗液置于離心管，12 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達情況，經細菌過濾器除菌后置于－20℃保存。

1.2.4 重組蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4抑菌活性測定 固體LB培養基融化后，待溫度降至50℃時，以1%的接種量加入過夜培養的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌液，混勻后立即倒平板，待平板凝固后在表面滴加2 μL蛋白提取液，以空載體表達產物作為陰性對照，用氨芐青霉素作為陽性對照，將平板置于37℃培養10 h后觀察結果。

1.2.5 重組蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4抑制人宮頸癌細胞HeLa增殖試驗 收集生長至對數期的HeLa細胞，調整細胞懸液濃度至5×104個/mL，加入96孔板（100 μL/孔）后，置5%CO2下，37℃孵育至細胞單層鋪滿孔底，加入蛋白提取液，每個樣品做3個重復。5%CO2，37℃孵育24 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞長勢。每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h；然后小心吸去孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩5 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀測量570 nm處各孔的吸光值。

1.2.6 蛹蟲草不同生長時期JRL-ccm4基因表達的相對定量 25℃，150 r/min振蕩培養4 d的蛹蟲草菌絲，過濾收集后置于－80℃保存；濾液中包含了大量芽生孢子，取200 μL濾液注射至單個蠶蛹，置于25℃培養20 d至蟲體長出菌絲體后，轉至22℃光照培養箱誘導原基形成，然后收集原基置于－80℃保存；繼續培養30 d至子實體成熟，收集子實體，同時提取菌絲、原基、子實體的總RNA，采用兩步法進行熒光定量PCR。

提取樣品總RNA后反轉錄為cDNA備用，選用微管蛋白基因（Tubulin）作為內參基因，使用DNAMAN軟件進行引物設計（表1）。反應體系（20 μL）為：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應條件：94℃，5 min；95℃30 s，60℃30 s，40個循環，72℃延伸5 min。

表1 熒光定量PCR使用引物Table 1 Primer for RT-PCR

2 結果與分析

2．1 蛹蟲草JRL-ccm4基因的生物信息學分析

蛹蟲草JRL-ccm4基因序列為2 292 bp，根據cDNA序列推導出所編碼的凝集素蛋白JRL-ccm4的氨基酸序列，共有764個氨基酸殘基，分別在186、376、523位氨基酸殘基處有糖基化位點，530—550位預測可能有一個跨膜結構，JRL-ccm4蛋白分子量為83.35kDa，理論等電點（pI）為8.76，不穩定系數為46.57，脂肪系數為71.69；無信號肽，亞細胞定位結果顯示該凝集素蛋白在線粒體基質中，置信度為76.2%。從第630—764個氨基酸殘基位置為保守結構域；將蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank數據庫中進行蛋白質同源性檢索，用ClustalX比對結果發現它與來源于布氏蟲草（C.brongniartii）、鐮刀菌（Fusarium langsethiae）、綠僵菌（Metarhizium brunneum）的凝集素蛋白相似性分別達到83.42%、55.64%和58.25%。由此可見，蛹蟲草JRL-ccm4基因編碼的蛋白JRL-ccm4與真菌凝集素蛋白家族具有同源性，可以判定為是一種新的真菌凝集素蛋白。

2．2 蛹蟲草JRL-ccm4基因的擴增與原核表達

利用DNAMAN軟件設計的引物序列為上游5’-GAATTCATGGCCCCCAGATTTCTC-3’，下游5’-GAATTCGTACGTATTACCCTCCG TCA-3’，將JRL-ccm4基因連入PET-32a載體。經測序驗證表達框正確，可以用于蛋白表達。在BL21菌株中經12 h誘導表達后，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達情況（圖1），可以發現經誘導的菌株中產生分子量約為80 kDa的蛋白條帶。

2．3 重組蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4抑菌及抑制人宮頸癌細胞HeLa增殖活性

蛹蟲草凝集素蛋白JRL-ccm4提取液對大腸桿菌生長無抑制作用，而對金黃色葡萄球菌有一定抑制效果，Amp作為陽性對照，抑菌圈直徑為（2.1±0.1）cm；JRL-ccm4蛋白抑菌圈直徑為（1.2±0.1）cm（圖2）。用蛋白濃度測定試劑盒測得蛋白提取液濃度為1.8 mg/mL，對人宮頸癌細胞HeLa增殖的抑制率為11.7%。

圖1 異源表達JRL-ccm4蛋白的SDS-PAGE分析Fig．1 SDS-PAGE for heterologous expression of JRL-ccm4

圖2 JRL-ccm4蛋白抑制金黃色葡萄球菌生長Fig．2 JRL-ccm4 inhibits the growth of Staphylococcus aureus

2．4 蛹蟲草不同生長時期JRL-ccm4基因表達的相對定量

不同生長時期的蛹蟲草形態見圖3。以菌絲期JRL-ccm4基因的表達量為對照組進行數據分析，原基期的表達量上調了3.49倍，子實體期較菌絲期上調了1.46倍，結果表明JRL-ccm4基因在原基期有較高的表達量，可能在原基形成或子實體形成過程中起到調節作用。

圖3 不同生長時期的蛹蟲草Fig．3 Different growing stage of C．militaris

3 討論

蛹蟲草的人工栽培獲得成功和系列產品的開發，豐富了食用菌類的滋補保健品和功能食品［9］。肖磊［10］曾經從蛹蟲草子實體中分離純化出了凝集素并做了生物活性分析，結果表明蛹蟲草凝集素對6種病原真菌有較強的抑制作用，皮下注射凝集素對小貓淋巴瘤有明顯的抑制作用，但對蛹蟲草凝集素在體內的作用以及相關分子生物學研究一直存在空白。

在本研究的前期工作中，通過對蛹蟲草的基因組和轉錄組數據分析，發現數個凝集素編碼基因并都具有一定水平的表達。本研究選擇其中表達水平較高的JRL-ccm4基因進行了常規的分子生物學研究，所建立的技術路徑和所獲得的研究結果對進一步在分子層面深入了解蛹蟲草凝集素的功能和開發價值提供了工作基礎。

本研究結果表明蛹蟲草JRL-ccm4基因在原基期的表達量最高，推測該基因可能與子實體發育調控相關聯。但是由于基因表達后還需要一個翻譯合成蛋白的過程，所以在蛹蟲草中Jacalin類凝集素的最高凝集活性也可能會出現在子實體生長階段，這與Nagata等［6］的研究發現灰樹花中Jacalin類凝集素的凝集活性在子實體階段達到最高的研究結果具有一致性。但是該基因是否是蛹蟲草子實體形成所必需的關鍵基因，以及Jacalin類凝集素在子實體發育中起何種作用，還需要通過基因敲除等研究手段加以深入研究。

［1］KUO Y C，LIN C Y，TSAI W J，et al.Growth inhibitors tumor cells inCordyceps sinensis other than cordycepin and polysaccharides［J］.Cancer Investigation，1994，12（6）：611-615.

［2］陳桂寶，羅梅初，劉實晶，等.蛹蟲草的藥理作用研究［J］.中草藥，1997，28（7）：415-417.

［3］GOLDSTEIN I J，HUGHES R C，MONSIGNY M，et al.What Should Be Called a Lectin［J］.Nature，1980，285（5760）：66-66.

［4］XIANG Y，SONG M，WEI Z Y，et al.A jacalin-related lectin-like gene in wheat is a component of the plant defence system［J］.Exp Bot，2001，62（15）：5471-5483.

［5］VAN BAMMEEJ E J M，BARRE A，ROUGE P，et al.Cytoplasmic nuclear plant lectins：a new story［J］.Trrends Plant Sci，2004，9（10）：484-489.

［6］NAGATA Y，YAMASHITA M，HONDA H，et al.Characterization，occurrence and molecular cloning of a lectin fromGrifola frondosa：jacalinrelated lectin of fungal origin［J］.Biosci Biotecchem，2005，69（12）：2374-2380.

［7］ZHENG P，XIA Y L，XIAO G H，et al.，Genome sequence of the insect pathogenic fungusCordyceps militaris，a valued traditional chinese medicine［J］Genome Biology，2011，12：R116.

［8］何述棟.黑蕓豆凝集素的純化和生物信息學及結構與功能特性研究［D］.哈爾濱：哈爾濱工業大學，2015.

［9］陳艷秋.蛹蟲草人工優質高產栽培技術研究［J］.中國食用菌，2002，21（5）：20-22.

［10］肖磊.蛹蟲草凝集素的純化、生化性質測定及其抗腫瘤、抗植物病原真菌的研究［D］.北京：中國農業大學，2004.

（責任編輯：張睿）

Preliminary study of a jacalin-related lectin-like gene JRL-ccm4 in Cordyceps militaris

BAO Da-peng1，MA Yuan-wei1，2，WANG Rong1，LIU Min-xiang1，MAO Wen-jun1，WANG Ying1*
（1Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；
2College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Through the Cordyceps militaris genome data mining，a lectin gene encoding JRL-ccm4 was found.In this research，the gene and its encoding product were analyzed by bioinformatics，and heterologously expressed and examined the biological activity of the protein in Escherichia coli.The JRL-ccm4 gene expression level in different growth periods of C.militaris was tested by qRT-PCR.The results showed that the JRL-ccm4 proteins had a JRL domain structure which could be successfully expressed in prokaryotic cells.The protein of the JRL-ccm4 could inhibit growth of Staphylococcus aureus and partly inhibit cervical cancer HeLa cell proliferation；the JRL-ccm4 had the highest amount of gene expression in stromata，which was 3.49 times that of hyphae period and 2.39 times in the period of the fruiting body.It suggested that the gene could be related to fruit body development.

Cordyceps militaris；Lectin；Bioinformatics analysis；Heterologous expression；Gene function

S567.35；S646

A

1000-3924（2016）06-001-04

2016-10-20

上海市青年人才成長計劃2015（1-10）

鮑大鵬（1969—），男，博士，研究員，主要從事真菌分子遺傳研究。E-mail：baodp＠hotmail.com，Tel：18918162096

*通信作者，E-mail：wyhrx＠126.com