靈芝液體深層發酵高產胞內多糖菌株的篩選及其動力學研究

王國瑞，馮 杰，馮 娜，唐傳紅，張勁松*

（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海市農業科學院食用菌研究所，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，國家食用菌加工技術研發分中心，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403）

靈芝液體深層發酵高產胞內多糖菌株的篩選及其動力學研究

王國瑞1，2，馮 杰2，馮 娜2，唐傳紅2，張勁松2*

（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海市農業科學院食用菌研究所，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，國家食用菌加工技術研發分中心，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403）

對實驗室保藏的72株靈芝菌株液體深層發酵的終生物量和胞內多糖兩個指標進行了分析，以胞內多糖得率為依據，篩選出了其中得率最高的G0041，G0045和G0059菌株，得率分別為（2.39±0.06）g/L、（2.28± 0.03）g/L和（2.74±0.12）g/L，且3菌株在5%和1%水平上均存在顯著性差異。對3個菌株進行動力學模型構建，得到了菌絲體生長、產物胞內多糖生成和底物葡萄糖消耗的動力學方程和方程參數；方程的建立為后續靈芝液體深層發酵胞內多糖的優化及其規模化生產提供了理論研究基礎。

靈芝；胞內多糖；液體深層發酵；發酵動力學

靈芝（Ganoderma lucidum Karst.），屬擔子菌綱（Basidiomycota）、多孔菌目（Polyporales）、靈芝科（Ganodermataceae）、靈芝屬（Ganoderma），是一種藥、食兩用真菌。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，具有調節免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗輻射、抗疲勞等多種生物活性。靈芝多糖的研究一直受到國內外學者的廣泛關注，已分離到的有200多種，大部分為β-型的葡聚糖，少數為α-型的葡聚糖［1］。

目前，靈芝的發酵生產主要有固體培養法和液體深層發酵法。液體深層發酵具有不受季節影響，生產周期短，顯著提高生產效率等優點，受到人們的廣泛關注，液體深層發酵技術成為獲取靈芝多糖類化合物的重要手段。Hsieh等［2］報道了在靈芝菌絲液體深層發酵中，氮限制能提高多糖的產量；Tang等［3］發現鎂離子和鉀離子能夠提高塊菌中的多糖含量；袁術斌［1］對不同靈芝菌株進行了篩選，發現液態發酵靈芝菌絲體胞內多糖含量最高的菌株含量可達到15.4%，胞外多糖含量最高的可達到14.2%；喬雙逵［5］研究發現，液體發酵中，靈芝胞外多糖在第5天積累到最高值，為0.472 g/L，發酵結束時，多糖產量降至最低值0.108 g/L；Fang等［6］發現小菌球有利于靈芝多糖的合成，當靈芝菌球直徑分別為＜1.2 mm、1.2—1.6 mm及＞1.6 mm，其單位菌體胞內多糖產量分別為85 mg/g、69 mg/g、55 mg/g；王磊等［1］對8種靈芝菌株進行篩選，其中濟寧圓芝菌絲體中多糖含量最高，為117.59 μg/mg；宋頻然等［3］篩選出1株強耐自身代謝產物胞外多糖反饋抑制、高產胞外多糖的靈芝菌株GL029，該菌株的胞外多糖產量達3.07 g/L；Zhu等［2］在培養中加入從菌塊中提取的多糖和蛋白激發因子，胞內多糖的含量和產量分別達到了（12.91±1.05）mg/（100 mg）和（1.94±0.18）g/L。

之前的研究報道中大多都是對靈芝液體深層發酵優化靈芝菌絲體的生產量以及胞外多糖產量的研究［10-13］，但是對靈芝菌絲體液態發酵過程中菌絲體生長的變化，底物的利用，以及胞內產物靈芝多糖的過程變化的系統研究則較少。系統研究靈芝菌絲體液體深層發酵的過程變化對于菌絲體生長的控制和調控靈芝多糖的產量具有重要的意義。通過液體深層發酵對實驗室保藏的72株靈芝菌株進行篩選，以期獲得高產胞內多糖的靈芝菌株，在前期篩選的基礎上對獲得的高產菌株進行動力學的研究，構建其動力學模型，通過動力學模型參數的解析，進一步了解靈芝液體深層發酵過程的動態變化，為后續的優化和規模化生產提供依據。

1 高產胞內多糖菌株的篩選

1．1 材料與方法

1.1.1 供篩選菌株

供篩選菌株的編號、名稱、來源見表1。

表1 供試靈芝菌株編號、名稱和來源Table 1 Codes，names and sources of G．lucidum strains tested

（續表1）

1.1.2 試驗設備

酶標儀，美國Bio-Tek公司Biotek-Synergy HT多功能酶標儀；離心機，美國Beckman公司Allegretm25R Centrifuge離心機；搖床，上海杜科自動化設備有限公司DKY-Ⅱ恒溫調速回轉式搖床；生化培養箱，上海一恒科技有限公司LRH-250生化培養箱。

1.1.3 供試培養基

斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），美國BD公司生產，稱取39 g固體粉末溶于1 000 mL蒸餾水，121℃滅菌15 min。

液體種子培養基：豆餅粉20 g/L；葡萄糖25 g/L；MgSO4·7H2O 1.5 g/L；KH2PO43 g/L；pH 5.4，121℃滅菌30 min。

液體發酵培養基：豆餅粉20 g/L；葡萄糖20 g/L；可溶性淀粉10 g/L；MgSO4·7H2O 1.5 g/L；KH2PO43 g/L；pH 5.4，121℃滅菌30 min。

1．2 方法

1.2.1 菌株培養

將菌種在固體平板上進行活化，26℃培養7 d，待菌絲布滿平板后，挑取黃豆大小的菌塊接入種子培養基中，然后置于旋轉式搖床上培養6—8 d（150 r/min，26℃），待小菌球基本布滿搖瓶；從搖床上取下搖瓶，按定量接種法將每個菌株接到發酵培養基中（接種量10%），在搖床上培養8 d（150 r/min，26℃），本試驗均設3個重復。

1.2.2 菌絲體生物量的測定

取適量發酵培養液將其在15 317 g下離心20 min，收集菌絲體于60℃烘箱烘干至恒重，稱重，求3個重復的平均值，以g/L計量。

1.2.3 菌絲體中含胞內多糖粗提液的制備

將烘干后的靈芝菌絲體研磨成粉末，稱取100 g加入100 mL蒸餾水，沸水浴提取3 h。冷卻后定容至100 mL，將溶液在15 317 g下離心15 min后取上清液備用［14］。

1.2.4 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法［15］。

1.2.5 還原糖含量的測定

采用3，5-二硝基水楊酸法［16］。

1．3 靈芝液體深層發酵動力學模型的構建

發酵動力學是研究發酵過程中菌體濃度、底物濃度和產物濃度等狀態變量隨發酵時間變化規律及控制變量之間的關系。研究靈芝液體深層發酵動力學可以清楚地了解發酵過程的動態變化。

1.3.1 菌體生成動力學模型的構建

本試驗中選擇Logistic［17］方程建立發酵過程菌絲體生長的動力學模型，方程如下：

當t＝0時，X＝X0為初始條件，（1-1）積分變形后為：

兩邊同時取對數得：

對方程（1-3）采用擬線性法作圖，直線的斜率為μm，截距為－ln（Xm/X0－1）。

式中：X——菌體干重（g/L）；X0——菌體的初始生物量（g/L）；Xm——菌體的最大生物量（g/L）；μm——最大比生長速率（h－1）；t——發酵時間（h）

1.3.2 產物生產動力學模型的建立

靈芝發酵產生胞內多糖與菌體的生長屬于部分相關的關系，可采用Luedeking-Piret［17］模型表示：

積分變換，結合（1-2）式得：

兩邊同時取對數，有

采用擬線性法求取參數α和β。

式中：P——產物（胞內多糖）的濃度（g/L）；P0——產物（胞內多糖）的初始濃度（g/L）；α、β——常數

1.3.3 底物消耗動力學模型的建立

對于葡萄糖消耗模型，采用Luedeking-Piret［17］方程

積分變換后，結合（1-2）式得：

兩邊同時取對數，得：

同樣采取擬線性法求得A和B。

式中：S——基質（葡萄糖）的濃度（g/L）；S0——基質（葡萄糖）的初始濃度（g/L）；A、B——常數

1．4 數據處理

試驗數據采用SPSS 20.0和DPS v 7.05數據處理軟件進行分析。

2 結果與分析

2．1 靈芝菌株液體深層發酵生理生化指標分析

對72株供試菌株進行液體發酵培養，分別測定其菌絲體生物量，胞內總糖含量和胞內還原糖含量，得出胞內多糖含量和胞內多糖得率。試驗結果如表2所示。

由表2分析可知，生物量較大的分別是G0068、G0099、G0157，含量分別為（21.81±5.75）g/L、（23.16± 2.16）g/L、（21.13±3.17）g/L；多糖含量較高的分別是G0059、G0100、G0195，含量分別為（21.10± 0.18）g/100 g菌絲體、（24.67±0.54）g/100 g菌絲體、（14.60±0.21）g/100 g菌絲體；胞內多糖得率較大的分別是G0041、G0045、G0059，含量分別為（2.39±0.06）g/L、（2.28±0.03）g/L、（2.74±0.12）g/L。

表2 不同菌株各參數試驗結果Table 2 Experimental results of different strains

菌絲體生物量和胞內多糖產量是判斷菌株性能優劣的重要指標，在篩選的72株菌株中，上述兩類卻具有不一致性，因此，將兩者統籌考慮，即以胞內多糖得率作為篩選依據，我們將72株菌株中胞內多糖得率排名前二十的菌株，即G0059、G0041、G0045、G0100、G0157、G0033、G0186、G0007、G0062、G0047、G0099、G0159、G0154、G0067、G0069、G0063、G0152、G0093、G0003、G0178，采用統計學中顯著性差異分析方法進行深入研究。菌株胞內多糖得率顯著性分析結果見表3。

通過差異顯著性分析可知，在5%顯著水平上，G0059、G0041、G0045、G0100和G0157差異顯著；G0157和G0033差異不顯著；G0186和G0007差異不顯著；G0007和G0062差異不顯著；G0062、G0047、G0099、G0159、G0154、G0067、G0069、G0063和G0152差異顯著；G0152和G0093之間差異不顯著；G0093、G0003和G0178差異顯著。在1%顯著水平上，G0059、G0041、G0045、G0100和G0157差異顯著；G0157和G0033差異不顯著；G0186、G0007和G0062差異不顯著；G0062和G0047差異不顯著；G0047、G0099、G0159、G0154、G0067、G0069、G0063和G0152差異顯著；G0152和G0093之間差異不顯著；G0003和G0178差異不顯著。此20株菌株中，G0059胞內多糖得率最高，為2.74 g/L，G0178胞內多糖得率最低，為1.53 g/L。

表3 20個菌株胞內多糖得率顯著性分析Table 3 Significance test for 20 strains’intracellular polysaccharide yields

圖1 靈芝液體深層發酵菌絲體生物量在發酵過程中的變化Fig．1 Biomass variation of G．lucidum mycelia during liquid submerged fermentation

2．2 高產胞內多糖靈芝菌株液體深層發酵過程研究

以上述研究為基礎，選取胞內多糖得率最高的3株菌，即G0059、G0041和G0045進行分析研究。對三株菌的菌絲體生物量、還原糖消耗量以及胞內多糖產量的過程曲線進行分析，如圖1—3所示。由圖1分析可知，3個菌株幾乎沒有延滯期，很快進入對數期，在發酵1 d后進入穩定期，G0045和G0059穩定期均比較長，G0041在第6天生物量又有大幅增長，達到9.25 g/L。圖2中，3株菌還原糖均在第1天消耗比較快，第8天降到最低點，為17.54 g/L，其中G0059消耗較緩慢，G0045消耗最多。圖3中，胞內多糖產量呈逐漸增加趨勢，G0059第1天增長最快，之后平穩增長，G0041和G0045前4 d呈指數增長，之后平穩增長，發酵第8天達到最大值，為1.70 g/L。

圖2 靈芝液體深層發酵培養液中還原糖的消耗Fig．2 Consumption of reducing sugar of G．lucidum liquid submerged fermentation medium

圖3 靈芝液體深層發酵胞內多糖產量Fig．3 Intracellular polysaccharide yield of G．lucidum liquid submerged fermentation

2．3 高產胞內多糖靈芝菌株液體深層發酵動力學參數比較

在5 L發酵罐中進行試驗，探討在發酵罐中分批發酵靈芝胞內多糖的條件和動力學特征，利用發酵試驗數據分別求得三個菌株動力學方程的各個參數。以G0041動力學方程參數求解過程為例，說明參數求解過程［18-19］。

G0041菌絲體生長動力學方程求解如下：

G0041產物生成動力學方程求解如下：

G0041底物消耗動力學方程求解如下：

用同一方法分別求得菌株G0045和G0059的動力學方程參數，最終所求的參數結果如表4所示。

表4 發酵動力學模型參數估計值Table 4 Parameter estimation of fermentation kinetic models

由表4分析可知，Xm為菌體的最大生物量，在相同的發酵條件下，G0041的最大生物量達到12.479 g/L，相比G0045和G0059分別高出89.19%、169.23%。X0為通過建立動力學模型求得的菌體初始生物量，三株菌相差較小，G0041分別比G0045和G0059高出9.27%、10.85%。μm為最大比生長速率，G0041、G0045、G0059分別達到了0.518 h－1、0.684 h－1、0.647 h－1，G0045和G0059分別比G0041高出32.05%、24.90%。α表示與菌體生長相關的產物生成系數，β表示與菌體濃度相關的產物生成系數，三組數據中α和β均不為0，靈芝菌絲體發酵屬于部分相關模型。A表示菌體生長相關的底物消耗系數，B表示與菌體濃度相關的底物消耗系數。

由表可見，在菌絲體生長期β非常小，接近于0，其意義為發酵在對數生長期，菌體大量生長，而產物只有少量合成，進入穩定生長期后，產物大量連續合成，因此發酵過程應屬于部分相關型發酵。

將表4所得到的參數分別代入公式（1-1），（1-4）和（1-7）即可得到G0041，G0045和G0059三株菌的發酵動力學方程（表5）。

表5 發酵動力學方程Table 5 Fermentation kinetic equations

3 結論

通過對72株菌株的篩選，獲得高產胞內多糖菌株3株，分別為G0041、G0045、G0059。對篩選獲得的3株菌進行了詳細的發酵過程研究，最大菌絲體生物量達到（23.16±2.16）g/L，最大胞內多糖產量達到（24.67±0.54）g/100 g菌絲體，最大得率達到（2.74±0.01）g/L。根據已有的動力學模型，對篩選獲得的三株菌的動力學參數進行求解，由動力學試驗得到菌絲體生物量，產物胞內多糖合成量，底物葡萄糖消耗量的動力學方程，方程反應了三者的變化規律及其相互關系。發酵動力學模型的建立對發酵過程如何進行有效調控、發酵工藝的最優化，以及最大限度地提高胞內多糖產量具有重大的意義。如衛功元等［20］研究谷胱甘肽不同溫度下細胞生長動力學參數之間的內在聯系，得到谷胱甘肽分批發酵過程中細胞濃度的變化同溫度以及底物濃度之間的關系，并驗證了模型的適用性。發酵動力學的研究有助于深入認識和掌握發酵過程，為確定最佳發酵工藝條件和建立發酵過程中菌體濃度、基質濃度、溫度、pH、溶氧等工藝參數的控制方案打下一定的基礎，為設計放大發酵規模和從分批發酵過渡到連續發酵提供一定的理論支持。發酵動力學模型的建立對于了解發酵過程中的動態行為，如菌絲體的生長，碳源和氮源的消耗等起到重要作用，為更加全面深刻地認識G0119發酵過程及大規模生產的發酵優化控制提供依據。

近年來，功能性食品的種類和數量不斷增多，靈芝多糖的生物活性越來越受到人們關注，所以，進一步全面研究發酵動力學，了解其發酵機理，開發高附加值的靈芝多糖產品，最大限度地開發和利用靈芝多糖將成為未來的研究重點。

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（責任編輯：程智強）

Screening and kinetic study of high-yield intracellular polysaccharide strains of Ganoderma lucidum in liquid submerged fermentation

WANG Guo-rui1，2，FENG Jie2，FENG Na2，TANG Chuan-hong2，ZHANG Jing-song2*
（1College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；Key Laboratory of Southern Edible Fungi Resources and Utilization，Ministry of Agriculture；National Engineering Research Center of Edible Fungi；National R＆D Subcenter for Edible Fungi Processing；Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201403，China）

The 72 strains of Ganoderma lucidum preserved in the laboratory were analyzed in terms of final biomass and synthetic intracellular polysaccharide indicators of liquid submerged fermentation，and 3 highest yield strains（G0041，G0045 and G0059）were selected according to intracellular polysaccharide yield，their yields being（2.39±0.06）g/L，（2.28±0.03）g/L and（2.74±0.12）g/L respectively and significantly different at 5%and 1%levels.The 3 strains’kinetic models were also established，obtaining their kinetic equations and equation parameters of mycelial growth，intracellular polysaccharide production and glucose consumption.The established equations provided a subsequent research basis for G.lucidum liquid submerged fermentation optimization and mass production.

Ganoderma lucidum；Intracellular polysaccharide；Liquid submerged fermentation；Fermentation kinetics

S567.3；S646

A

1000-3924（2016）06-010-08

2015-10-22

上海市科技興農重點攻關項目［滬農科攻字（2016）第5-4號］

王國瑞（1989—），女，在讀碩士，研究方向：藥用真菌

*通信作者，E-mail：syja16＠saas.sh.cn